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《沈阳农业大学》 2017年
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蓝靛果花色苷提取物调节胆固醇代谢机理研究

刘素稳  
【摘要】:蓝靛果(Lonicera caerulea L.var.edulis)属于忍冬科,小灌木,可食用浆果。野生品种在我国东北广泛种植。果中含有大量花色苷,类黄酮和酚酸,具有多种生理活性。本研究分析了蓝靛果花色苷提取物的结构组成,分析了冷加工方法中高静水压(HHP)技术对花色苷提取物组成及抗氧化活性的影响。重点对蓝靛果提取物调节胆固醇代谢的生理活性进行了体内和体外研究,以明确其生物活性和机理,为更好地开发和利用蓝靛果资源提供理论依据。1.蓝靛果花色苷提取优化研究:以乙醇、甲醇、丙酮及其水溶液为提取溶剂,采用震荡辅助溶剂萃取法提取蓝靛果花色苷,比较了不同提取剂提取能力的差异。HPLC-DAD分离显示,3,5,10号物质(矢车菊-3-葡萄糖苷-儿茶素,矢车菊3-葡萄糖苷,芍药-3-芸香糖苷)含量在不同提取剂中影响较大,差异显著(p0.05)。在单因素实验基础上,常温30℃震荡辅助提取蓝靛果花色苷,采用中心组合响应面法研究数据进行多元回归拟合,得花色苷提取量Y对其影响的关键因子(料液比X1、提取时间X2、乙醇提取浓度X3)的二次多项式回归模型。分析结果表明:一次项料液比对提取率影响达极显著水平(P0.01),提取时间和乙醇浓度达显著水平(P0.05)。料液比,提取时间和乙醇浓度的交互作用对蓝靛果花色苷提取率有较大影响。验证后的最佳提取参数为料液比1:19,提取时间67 min,乙醇浓度69%,震荡提取转数为160 r/min,温度30℃,pH2.0。此时,蓝靛果花色苷提取量为310.36±5.326mg/100gFW,模型和预测值相吻合。通过动态吸附和解吸实验,对所提花色苷进行了 AB-8大孔树脂纯化,蓝靛果提取物冷冻干燥后为黑红色粉末,花色苷回收率86.2%。2.HHP处理对蓝靛果花色苷提取物的影响:蓝靛果经高静水压处理(HHP活性组分提取条件及商业灭菌条件)与鲜果对照组和热处理组进行比较,评价HHP对蓝靛果浆花色苷总量,花色苷单体,总酚,抗坏血酸,及花色苷提取物抗氧化性能的影响。经HPLC-DAD-ESI/MS2鉴定,获得蓝靛果13中单体花色苷,矢车菊-3-葡萄糖苷是主要花色苷含量达到82.68%。200 MPa保持5 min和10 min的HHP处理使花色苷、多酚的含量提高,总酚溶出增加14.35%,花色苷溶出增加6.84%(p0.05)。采用三种方法(DPPH自由基清除法,ORACFL实验和CAA抗氧化法)对经过HHP处理的蓝靛果花色苷提取物进行了抗氧化能力测定。结果表明,同样能够灭菌的高压处理组,低压作用长时间(400 MPa/20 min)比高压短时(600 MPa/10 min)更多花色苷等活性组分被保留,抗氧化活性较强。另外低压如200 MPa/5 min和10 min可促进细胞内花色苷等活性组分释放,含量增多,抗氧化活性增强。3.蓝靛果花色苷提取物调节胆固醇代谢体外研究:实验对蓝靛果花色苷提取物(LCBE)中的组分通过HPLC-DVD-ESI/MS/MS技术进行了定性和定量分析。通过Caco-2细胞单层模型,研究了 LCBE对胆固醇的吸收和胆固醇流出及合成至关重要的调控基因表达的影响。结果表明,40和80 μg/mLLCBE能够显著减少胆固醇的吸收、转运和抑制胆固醇的积聚。采用油红O染色技术对处理后的细胞进行了染色分析。采用实时PCR和Western blot技术对各组细胞进行了mRNA和蛋白表达水平测定。结果表明,在胆固醇吸收试验中,胆固醇合成关键蛋白SREBP2,吸收转运蛋白NPC1L1和ACAT2表达被LCBE显著抑制(p0.01)。而且,LCBE表现出潜在的促进胆固醇外排的功能,通过上调ABCA1,和ABCG5/G8mRNA和蛋白表达水平(p0.01)。因此可以推测,LCBE通过多种机制调节高胆固醇血症,包括下调胆固醇生物合成、吸收和上调胆固醇外排基因和蛋白的表达。4.蓝靛果花色苷提取物调节胆固醇代谢体内研究:本实验测定了蓝靛果花色苷提取物对高胆固醇膳食(HCD)诱导的高血脂症大鼠的胆固醇代谢调节的生理活性。SD大鼠饲喂HCD的同时,灌胃补充LCBE(75,150和300mg/kg体重)12周,测定血脂及胆固醇变化,采用实时定量PCR分析LCBE对HCD大鼠肝脏胆固醇合成基因SREBP2,miR-33和miR-122及其靶基因ABCA1,FAS和NPC1 mRNA水平,以及胆固醇代谢为胆汁酸的相关基因PPARy,LXRα,CYP7A1 mRNA水平。大鼠小肠mRNANPC1L1,ACAT2,MTP和ABCG5/8也一并进行了检测。并通过蛋白免疫印迹分析了肝脏SREBP2,ABCA1,FAS 和 NPC1,和小肠NPC1L1,ACAT2,MTP 和 ABCG5/8等蛋白的表达水平。实验研究发现,LCBE膳食增补与HCD模型组相比,显著降低TC,TG,LDL-C,肝脏胆固醇水平和提高HDL-C。除了腹部脂肪,膳食增补LCBE显著降低高血脂症大鼠体重和器官重量(p0.01)。膳食增补LCBE显著改善血脂异常并降低高血脂症大鼠的肝脏胆固醇水平(p0.01),并显著改善胸主动脉和肝脏脂肪和胆固醇的积聚。促进大鼠粪便更多中性和酸性固醇排泄(p0.01),并提高结肠,结肠内容物和血液抗氧化能力,降低血浆中TMAO水平。分子水平研究结果表明,膳食LCBE増补可显著提高胆固醇代谢为胆汁酸的能力,并通过上调PPARy-LXRα-CYP7A1/ABCA1信号通路增加胆固醇外排,通过下调胆固醇合成基因SREEBP2mRNA和蛋白表达降低胆固醇的肝脏合成。另外,LCBE使小肠NPC1L1,ACAT2和MTP蛋白表达减少和ABCG5/8表达增加(p0.01)。以上结果表明,LCBE对胆固醇的代谢活性为通过减少胆固醇的内生合成,增加胆固醇逆向转运,以及提高机体对胆固醇的外排能力等多种途径平衡胆固醇的代谢。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:TS264.4;TS201.4

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