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《沈阳农业大学》 2018年
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里氏木霉木聚糖酶XynⅡ的分子改造、固定化及木聚糖代谢途径构建

张艺峰  
【摘要】:木聚糖酶,一种降解木聚糖的β-1,4糖苷键的降解酶系,在农业残留物生物转化,如纸浆的预漂白、果汁澄清、植物油提取及动物饲料原料消化率的提高等领域具有广泛的应用价值。来自里氏木霉的木聚糖酶Xyn II具有催化活性高、稳定性好的特点,具有良好的应用前景。本研究对Xyn II进行了异源表达、酶的固定化和分子改造。在此基础上,以大肠杆菌为表达宿主,构建了新的木聚糖代谢途径,从而为以木聚糖为主要成分的生物质资源的综合利用奠定了基础。首先,本研究设计和制备了磁性琼脂糖金属微球载体,同步实现了木聚糖酶XynII的纯化和固定化。系统研究了该载体的固定条件、酶浓度、温度、pH值等因素对酶催化活性的影响。结果表明,固定化木聚糖酶显示出比游离酶更好的热稳定性,其热稳定性比游离酶提高;固定化酶具有良好的储存稳定性,储存35天后保持80%的活性;另外,固定化酶表现出极高的重复利用率,重复使用5次情况下,剩余酶活性约为80%左右。有趣的是,固定化木聚糖酶比游离酶具有更高的有机溶剂稳定性,比如在25%的乙醇、丙酮和丁醇溶液中,固定化酶的活性分别是游离酶的1.5、1.8和12.6倍。表明固定在磁性高分子金属微球上的酶应该特别适用于催化有机溶剂中的反应。第二,本研究将可得然胶、钙离子和钴离子用于磁性可得然胶金属微球载体的制备,并同步实现了木聚糖酶XynII的纯化和固定化,系统研究了该载体的固定条件、酶浓度、温度、pH值等因素对酶催化活性的影响。结果表明,固定化酶具有良好的储存稳定性,储存35天后保持80%的活性;另外,固定化酶表现出极高的重复利用率,重复使用5次情况下,剩余酶活性为80%。固定化木聚糖酶比游离酶具有更高的有机溶剂稳定性,比如在25%的乙醇、丙酮和丁醇溶液中,固定化酶的活性分别是游离酶的1.5、2.83和17.4倍。表明基于可得然胶、钙离子和钴离子的磁性高分子金属微球用于酶的固定化,特别适用于催化有机溶剂中的反应。特别值得一提的是,磁性可得然胶钴离子微球固定化酶在热稳定性方面显著优于磁性可得然胶钙离子微球和游离酶,说明该固定化酶具有更为优异的性质。此外,我们还对比了His标签纯化试剂盒Ni-NTA和磁性可得然胶金属微球对酶的纯化效果。结果表明,磁性可得然胶金属微球与Ni-NTA具有相似的纯化蛋白能力,但是磁性可得然胶金属微球的重复使用效果优于Ni-NTA,表明磁性可得然胶金属微球在蛋白纯化方面也将具有非常广泛的应用前景。另外,通过比对磁性琼脂糖金属微球和磁性可得然胶金属微球,发现磁性可得然胶金属微球对酶的固载量是磁性琼脂糖金属微球的1.5倍,表现出更优异的载体特征。第三,本研究将采用本实验室新设计的一种宏基因组区段改组方法,实现对XynII的分子改造。在本研究中,我们将通过木聚糖酶基因比对,确定该酶的保守区段,然后利用CODEHOP原理,在相邻的两个保守区设计简并引物。以宏基因组DNA为模板,用这些简并引物特异性地扩增两个保守区之间的DNA序列,然后通过重叠延伸PCR的方式,替代XynII的相应区段,实现Xyn II的分子改造。通过筛选,获得了8个突变酶基因,为后续的酶活性测定奠定了基础,也为后续的进一步构建突变酶提供了参考。与传统的分子改造方法相比,宏基因组区段改组方法能够充分利用宏基因组库的DNA资源,而且具有简单、高效、新基因筛选周期短的优点,因此具有广泛的应用前景。第四,本研究克隆了菊欧文氏菌的木糖异构酶基因Dd-XIase,并在大肠杆菌中进行了异源表达。在此基础上,构建了含有木聚糖酶基因、木糖苷酶基因和木糖异构酶基因的木聚糖代谢途径。结果表明,Dd-XIase具有良好的温度稳定性,并且在pH研究方面展示出了极强的碱耐受性,具有一定的生产应用价值。此外,研究表明,10%正丁醇和10%乙醇溶液能够促进Dd-XIase的酶活,其原因有待进一步分析。在金属离子耐受性方面,Ag~+、Ca~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、K~+、Li~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Rb~(2+)和EDTA均能起到促进酶活的作用。上述研究结果表明,Dd-XIase可能在恶劣环境下有很高的应用价值。对于底物特异性的研究结果表明,D-葡萄糖底物特异性最高,D-木糖次之。在此基础上,将木聚糖酶基因、木糖苷酶基因和木糖异构酶基因克隆到同一表达载体上,从而构建了一个能将木聚糖代谢产生D-木酮糖的代谢途径,为后续的木聚糖高效利用奠定了坚实的基础。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q814;Q78

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 王怀蓬;乌日娜;;低聚木糖对AA肉仔鸡生产性能和屠宰性能的影响[J];粮食与饲料工业;2008年07期
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1 范光森;樟绒枝霉耐热木聚糖酶的纯化、性质和应用研究[D];中国农业大学;2014年
【共引文献】
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1 郭芳;孙亚楠;周岩民;王恬;;复合寡糖对肉鸡生产性能和免疫器官指数的影响[J];家畜生态学报;2009年04期
2 郭芳;孙亚楠;周岩民;王恬;;复合寡糖对肉鸡生产性能和免疫器官指数的影响[J];粮食与饲料工业;2009年06期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前3条
1 勇强;余世袁;杜文兴;刘文斌;朱汉静;;低聚木糖的生产与应用[J];饲料与畜牧;2006年09期
2 徐勇,顾阳,陈牧,勇强,余世袁;低聚木糖对蛋鸡的促生长作用及促生长机理研究[J];饲料工业;2005年22期
3 许梓荣,胡彩虹;寡果糖对肥育猪生长性能、肠道菌群和免疫功能的影响[J];中国兽医学报;2003年01期
【相似文献】
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1 陆长梅,李继影,陈阳,袁生;XynⅢ包涵体的纯化与变复性研究[J];南京师大学报(自然科学版);2004年04期
2 王国才;XYN□—12型箱型移开式金属封闭开关设备[J];高压电器;1998年04期
3 王孟兰;赵妍;陈明杰;汪虹;;草菇不同菌株木聚糖酶xyn基因的表达及其酶活性分析[J];菌物学报;2014年05期
4 韩承业;余世袁;欧阳嘉;李鑫;周娟;许艳;;定点突变提高里氏木霉木聚糖酶(XYN Ⅱ)的稳定性[J];生物工程学报;2010年05期
5 闫欣;李延兰;丰慧根;陈红歌;;黑曲霉木聚糖酶XynⅢ的纯化与酶学性质[J];河南农业大学学报;2007年01期
6 何军;余冰;张克英;陈代文;;里氏木霉木聚糖酶基因(XynⅡ)在毕赤酵母中异源表达及重组蛋白酶学性质分析[J];农业生物技术学报;2009年05期
7 周晨妍;白剑宇;邬敏辰;王武;;宇佐美曲霉木聚糖酶(xynⅡ)基因在大肠杆菌中的表达[J];农业生物技术学报;2007年03期
8 周晨妍;符丹丹;丰慧根;邬敏辰;王武;;酸性木聚糖酶XynⅡ活性中心关键氨基酸残基的鉴定[J];生物技术;2010年02期
9 周晨妍;李东峰;邬敏辰;王武;;木聚糖酶XynⅡ的D37N突变、表达及酶学性质变化[J];生物加工过程;2008年03期
10 周晨妍;邬敏辰;李东峰;王瑾;王武;;宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达[J];生物加工过程;2008年02期
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1 赵妍;王梦兰;陈明杰;;草菇不同菌株木聚糖酶xyn基因的表达及其酶活性分析[A];中国菌物学会2016年学术年会论文摘要集[C];2016年
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1 张艺峰;里氏木霉木聚糖酶XynⅡ的分子改造、固定化及木聚糖代谢途径构建[D];沈阳农业大学;2018年
2 黄中璞;耐酸性黑曲霉木聚糖酶XynⅢ的改造和定点突变研究[D];河南农业大学;2011年
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6 张璋;木聚糖酶XynⅢ的N-端融合纤维素结合结构域CBD_1/CBD_2的研究[D];河南农业大学;2012年
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