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《沈阳农业大学》 2018年
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里氏木霉木聚糖酶XynⅡ的分子改造、固定化及木聚糖代谢途径构建

张艺峰  
【摘要】:木聚糖酶,一种降解木聚糖的β-1,4糖苷键的降解酶系,在农业残留物生物转化,如纸浆的预漂白、果汁澄清、植物油提取及动物饲料原料消化率的提高等领域具有广泛的应用价值。来自里氏木霉的木聚糖酶Xyn II具有催化活性高、稳定性好的特点,具有良好的应用前景。本研究对Xyn II进行了异源表达、酶的固定化和分子改造。在此基础上,以大肠杆菌为表达宿主,构建了新的木聚糖代谢途径,从而为以木聚糖为主要成分的生物质资源的综合利用奠定了基础。首先,本研究设计和制备了磁性琼脂糖金属微球载体,同步实现了木聚糖酶XynII的纯化和固定化。系统研究了该载体的固定条件、酶浓度、温度、pH值等因素对酶催化活性的影响。结果表明,固定化木聚糖酶显示出比游离酶更好的热稳定性,其热稳定性比游离酶提高;固定化酶具有良好的储存稳定性,储存35天后保持80%的活性;另外,固定化酶表现出极高的重复利用率,重复使用5次情况下,剩余酶活性约为80%左右。有趣的是,固定化木聚糖酶比游离酶具有更高的有机溶剂稳定性,比如在25%的乙醇、丙酮和丁醇溶液中,固定化酶的活性分别是游离酶的1.5、1.8和12.6倍。表明固定在磁性高分子金属微球上的酶应该特别适用于催化有机溶剂中的反应。第二,本研究将可得然胶、钙离子和钴离子用于磁性可得然胶金属微球载体的制备,并同步实现了木聚糖酶XynII的纯化和固定化,系统研究了该载体的固定条件、酶浓度、温度、pH值等因素对酶催化活性的影响。结果表明,固定化酶具有良好的储存稳定性,储存35天后保持80%的活性;另外,固定化酶表现出极高的重复利用率,重复使用5次情况下,剩余酶活性为80%。固定化木聚糖酶比游离酶具有更高的有机溶剂稳定性,比如在25%的乙醇、丙酮和丁醇溶液中,固定化酶的活性分别是游离酶的1.5、2.83和17.4倍。表明基于可得然胶、钙离子和钴离子的磁性高分子金属微球用于酶的固定化,特别适用于催化有机溶剂中的反应。特别值得一提的是,磁性可得然胶钴离子微球固定化酶在热稳定性方面显著优于磁性可得然胶钙离子微球和游离酶,说明该固定化酶具有更为优异的性质。此外,我们还对比了His标签纯化试剂盒Ni-NTA和磁性可得然胶金属微球对酶的纯化效果。结果表明,磁性可得然胶金属微球与Ni-NTA具有相似的纯化蛋白能力,但是磁性可得然胶金属微球的重复使用效果优于Ni-NTA,表明磁性可得然胶金属微球在蛋白纯化方面也将具有非常广泛的应用前景。另外,通过比对磁性琼脂糖金属微球和磁性可得然胶金属微球,发现磁性可得然胶金属微球对酶的固载量是磁性琼脂糖金属微球的1.5倍,表现出更优异的载体特征。第三,本研究将采用本实验室新设计的一种宏基因组区段改组方法,实现对XynII的分子改造。在本研究中,我们将通过木聚糖酶基因比对,确定该酶的保守区段,然后利用CODEHOP原理,在相邻的两个保守区设计简并引物。以宏基因组DNA为模板,用这些简并引物特异性地扩增两个保守区之间的DNA序列,然后通过重叠延伸PCR的方式,替代XynII的相应区段,实现Xyn II的分子改造。通过筛选,获得了8个突变酶基因,为后续的酶活性测定奠定了基础,也为后续的进一步构建突变酶提供了参考。与传统的分子改造方法相比,宏基因组区段改组方法能够充分利用宏基因组库的DNA资源,而且具有简单、高效、新基因筛选周期短的优点,因此具有广泛的应用前景。第四,本研究克隆了菊欧文氏菌的木糖异构酶基因Dd-XIase,并在大肠杆菌中进行了异源表达。在此基础上,构建了含有木聚糖酶基因、木糖苷酶基因和木糖异构酶基因的木聚糖代谢途径。结果表明,Dd-XIase具有良好的温度稳定性,并且在pH研究方面展示出了极强的碱耐受性,具有一定的生产应用价值。此外,研究表明,10%正丁醇和10%乙醇溶液能够促进Dd-XIase的酶活,其原因有待进一步分析。在金属离子耐受性方面,Ag~+、Ca~(2+)、Co~(2+)、Cu~(2+)、K~+、Li~+、Mg~(2+)、Mn~(2+)、Rb~(2+)和EDTA均能起到促进酶活的作用。上述研究结果表明,Dd-XIase可能在恶劣环境下有很高的应用价值。对于底物特异性的研究结果表明,D-葡萄糖底物特异性最高,D-木糖次之。在此基础上,将木聚糖酶基因、木糖苷酶基因和木糖异构酶基因克隆到同一表达载体上,从而构建了一个能将木聚糖代谢产生D-木酮糖的代谢途径,为后续的木聚糖高效利用奠定了坚实的基础。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q814;Q78

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 张燕青;张超群;王浩猛;;木聚糖酶的分子改造方法及其工业应用研究现状[J];中国酿造;2018年01期
2 赵恒毅;胡梦薇;史玉欢;王宇;祁红;荣征星;徐见容;王昊;;M1毒蕈碱乙酰胆碱受体同源建模模板的选取及验证[J];现代生物医学进展;2017年32期
3 郭静;饶志明;杨套伟;满在伟;张显;徐美娟;李星;;理性设计定点突变提高Streptomyces kathirae SC-1酪氨酸酶热稳定性[J];食品与生物技术学报;2017年09期
4 易旭东;潘虎;田云;刘博伦;林元山;;一株碱性木聚糖酶产生菌的筛选及发酵条件的优化[J];中国农学通报;2017年17期
5 陈洪洋;蔡俊;林建国;王常高;杜馨;;木聚糖酶的研究进展[J];中国酿造;2016年11期
6 魏川子;王兆斌;李燕蒙;郑飞;王扣扣;胡洪;;半纤维素酶在畜禽饲料中的应用及研究进展[J];畜牧与饲料科学;2015年12期
7 林小洪;林娟;王国增;叶秀云;黄小云;;海洋来源芽孢杆菌产木聚糖酶的条件研究[J];中国食品学报;2015年11期
8 熊科;高乐;杨玉焕;崔晓亭;李秀婷;;基于土壤宏基因组文库筛选非培养木聚糖酶基因[J];食品与发酵工业;2015年10期
9 闵兆升;郭会明;顾承真;洪厚胜;;木聚糖酶及其在食品工业中的应用[J];食品与发酵工业;2013年10期
10 朱由彩;李吕木;钱坤;;木聚糖酶在肉仔鸡日粮中的应用[J];中国饲料;2012年15期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 范光森;樟绒枝霉耐热木聚糖酶的纯化、性质和应用研究[D];中国农业大学;2014年
【共引文献】
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1 贾先岩;;木聚糖酶的微生物生产技术及应用[J];青海科技;2018年03期
2 王萌萌;黄亮;张怡;班立桐;;糙皮侧耳液体发酵产木聚糖酶的条件优化[J];天津农林科技;2018年02期
3 张笑雨;高思宇;李秀婷;杨然;;N糖基化对重组木聚糖酶XynA酶学特性的影响[J];食品工业科技;2018年11期
4 汤回花;滕超;刘丹蕾;鹿发展;;盐析和双水相萃取法纯化细菌木聚糖酶的比较[J];食品工业科技;2018年12期
5 郑虹;李莉娟;童秋霞;陈联邦;王艳君;季潇炜;邓加聪;;一株高产木聚糖酶菌株的筛选鉴定及酶学特性研究[J];食品工业科技;2018年06期
6 梁忠原;;木聚糖酶在饲料中的应用[J];养殖与饲料;2017年05期
7 高雅君;丁长河;;木聚糖酶在食品工业中的应用研究进展[J];粮食与食品工业;2017年02期
8 王雄;陈清华;丁增辉;王兴吉;;两种木聚糖酶对黄羽肉鸡生长性能和养分代谢率的影响[J];中国畜牧兽医;2016年07期
9 赵兴秀;何义国;赵长青;张静;邹伟;方春玉;;白酒丢糟中功能性低聚木糖的提取研究[J];食品工业;2016年05期
10 王锐丽;叶兆伟;薛业敏;;重组酶Xar的表达纯化及性质研究[J];河南农业科学;2016年05期
【二级参考文献】
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1 雷洁琼;;木聚糖酶的研究进展和应用[J];青海畜牧兽医杂志;2016年02期
2 赵丽君;刘文;牛梅红;周立春;;木聚糖酶在制浆造纸上的应用及研究进展[J];天津造纸;2015年04期
3 陈亚文;周晨妍;谢晶晶;索婧琪;魏阳阳;李同彪;;引入中性氨基酸对木聚糖酶XynZF-2热稳定性的影响[J];中国酿造;2015年10期
4 冯波;尹翌;易旭东;林元山;;康氏木霉固体发酵木聚糖酶条件的研究[J];中国酿造;2015年10期
5 杜敏;李新平;陈立红;王志杰;李鸿魁;;木聚糖酶处理对漂白针叶木纤维形态和纤维素聚集态结构的影响[J];纸和造纸;2015年09期
6 李同彪;周晨妍;朱新术;王丹丹;;引入疏水性氨基酸对GH11家族木聚糖酶热稳定性的影响[J];食品工业科技;2016年01期
7 王显伦;任顺成;潘思轶;曹丽萍;;木聚糖酶对面团流变性和热力学特性的影响[J];食品科学;2015年07期
8 陈磊;赵祥颖;刘建军;;木聚糖酶研究进展[J];山东食品发酵;2014年04期
9 王苑;陈宝江;于会民;梁陈冲;王吉峰;任冰;;甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、木聚糖酶及地衣芽孢杆菌不同配伍对猪生长性能的影响[J];饲料研究;2014年21期
10 郄卫那;张兰英;何健;贺芹;;微生物产木聚糖酶研究进展[J];江苏农业科学;2014年07期
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1 陆长梅,李继影,陈阳,袁生;XynⅢ包涵体的纯化与变复性研究[J];南京师大学报(自然科学版);2004年04期
2 王国才;XYN□—12型箱型移开式金属封闭开关设备[J];高压电器;1998年04期
3 王孟兰;赵妍;陈明杰;汪虹;;草菇不同菌株木聚糖酶xyn基因的表达及其酶活性分析[J];菌物学报;2014年05期
4 韩承业;余世袁;欧阳嘉;李鑫;周娟;许艳;;定点突变提高里氏木霉木聚糖酶(XYN Ⅱ)的稳定性[J];生物工程学报;2010年05期
5 闫欣;李延兰;丰慧根;陈红歌;;黑曲霉木聚糖酶XynⅢ的纯化与酶学性质[J];河南农业大学学报;2007年01期
6 何军;余冰;张克英;陈代文;;里氏木霉木聚糖酶基因(XynⅡ)在毕赤酵母中异源表达及重组蛋白酶学性质分析[J];农业生物技术学报;2009年05期
7 周晨妍;白剑宇;邬敏辰;王武;;宇佐美曲霉木聚糖酶(xynⅡ)基因在大肠杆菌中的表达[J];农业生物技术学报;2007年03期
8 周晨妍;符丹丹;丰慧根;邬敏辰;王武;;酸性木聚糖酶XynⅡ活性中心关键氨基酸残基的鉴定[J];生物技术;2010年02期
9 周晨妍;李东峰;邬敏辰;王武;;木聚糖酶XynⅡ的D37N突变、表达及酶学性质变化[J];生物加工过程;2008年03期
10 周晨妍;邬敏辰;李东峰;王瑾;王武;;宇佐美曲霉木聚糖酶基因xynⅡ在不同毕赤酵母中的分泌表达[J];生物加工过程;2008年02期
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1 赵妍;王梦兰;陈明杰;;草菇不同菌株木聚糖酶xyn基因的表达及其酶活性分析[A];中国菌物学会2016年学术年会论文摘要集[C];2016年
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1 张艺峰;里氏木霉木聚糖酶XynⅡ的分子改造、固定化及木聚糖代谢途径构建[D];沈阳农业大学;2018年
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