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《沈阳农业大学》 2018年
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莱茵衣藻温度敏感型细胞分裂周期变异对其中性脂肪积累的影响

刘俊希  
【摘要】:微藻是一种生长速度快,世代周期简单,环境适应能力强,分布广泛的一种低等植物,适合开放式的大规模培养,可将太阳能直接转化成化学能并积累油脂,具有广泛的和潜在的工业应用前景。莱茵衣藻Chlamydomoans reinhardtii是一种单细胞真核绿藻,它们能够利用光合作用积累中性脂肪和用来生产生物柴油。衣藻是研究绿色微藻的主要模式藻株,在工业生产中,可以通过诱变育种、选择性育种、细胞融合和基因工程等手段获得特异性较高且性状稳定的藻株。本研究采用紫外线诱变定向选育莱茵衣藻的方法筛选高生物量和高油脂产量的优良衣藻藻株。本研究首先通过变异藻株对限制性温度的敏感性筛选出莱茵衣藻温度敏感型变异体(ts)。其次,本研究通过对温度敏感型变异体的巨型细胞的末端表型进一步筛选出细胞分裂周期变异体(cdc)。最后,本研究对筛选出来的莱茵衣藻温度敏感型细胞分裂周期变异体(ts cdc)当中的中性脂肪和三酰甘油(TAG)的积累、脂肪酸组分以及DNA的含量进行分析,研究结果发现:1.利用紫外诱变筛选了7500个莱茵衣藻单藻落,平均致死率为65%,其中筛选出15个温度敏感型(ts)变异体,该类变异体在限制性温度下发生突变的基因的热稳定性发生了变化。2.通过显微镜观测莱茵衣藻ts变异体,进一步筛选出3个莱茵衣藻温度敏感型细胞分裂周期(ts cdc)变异体,该类变异体在22℃的条件下正常生长,当温度升高到限制性温度时,细胞仍继续生长但不进行分裂,最终以巨型细胞的末端表型存在。3.通过荧光显微镜观测莱茵衣藻ts cdc变异体细胞内的中性脂肪荧光,结果发现该类变异体在22℃的条件下不积累中性脂肪。只有将该类变异体转移至限制性温度下后,变异体细胞的体积开始增大并产生中性脂肪荧光。4.使用薄层分析法(TLC)对莱茵衣藻ts cdc中TAG的积累进行验证,结果发现野生型莱茵衣藻在氮元素缺失的条件下与莱茵衣藻ts cdc变异体在氮元素完全的条件下的细胞内TAG的积累情况大致相同。在以上两种状态下的莱茵衣藻野生型细胞和ts cdc变异体细胞均无法进行正常的细胞分裂而积累TAG。5.使用GC-MS将莱茵衣藻ts cdc变异体中的中性脂肪和极性脂肪分离并进行脂肪酸的组分分析。结果发现,莱茵衣藻ts cdc变异体在限制性温度下显示出饱和脂肪酸的增加并伴随着多不饱和脂肪酸的减少,说明其脂肪酸组分从极性脂肪为主转向以中性脂肪为主。6.使用荧光显微镜对莱茵衣藻ts cdc变异体进行细胞核DNA染色分析。结果发现,莱茵衣藻ts cdc变异体在限制性温度条件下只观测到一个明显的细胞核DNA荧光并呈现出无鞭毛的细胞形态。因此,根据莱茵衣藻的细胞周期推测该类ts cdc变异体的细胞周期停滞在DNA合成之后和细胞分裂之前。综上所述,本研究利用UV紫外诱变的方法筛选和分离出莱茵衣藻温度敏感型细胞分裂周期变异体(ts cdc)藻株。该类ts cdc变异体藻株在限制性温度下增加细胞的体积而不继续进行分裂并在营养条件完全的条件下能够在细胞内积累中性脂肪或三酰甘油(TAG)。本研究所筛选出来的微藻变异体不需要以降低细胞的生长速率为代价,在工业生产中可以通过温度调节有效的启动从生物质的生产到油脂积累的过程,在利用微藻制取生物柴油领域里具有广泛的应用前景。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q943

【参考文献】
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