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《沈阳农业大学》 2002年
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抗真菌生物农药—凯地菌素的研究

刘秋  
【摘要】: 本文针对植物真菌病害研究开发出了新型农用抗生素-凯地菌素。从菌种的筛选鉴定、原生质体融合、发酵条件的优化、活性组分的分离、理化性质及类型确定、田间防效等几个方面进行了系列研究,结果如下: 1、通过广泛筛选,获得了具有自主知识产权的生防菌株SY20-2和SY20-4。利用稀释分离法从全国13个地区37份样品的土壤中共分离到各种链霉菌菌株686份,采用活体平板测定法共获得对植物病原真菌具有拮抗作用的链霉菌菌株19份;采用杯碟法测定筛选的各菌株发酵液抑菌活性,其中发酵液抑菌圈直径超过15mm的菌株有5个。其中优势菌株SY20—2、SY20-4,无论其活体还是其发酵液对番茄叶霉病菌、番茄灰霉病菌等多种植物病原真菌抑制率均接近或超过90%。同时二者对植物病原细菌也具有很好的抑菌活性。 2、利用传统分类法明确了菌株SY20—2、SY20—4的分类地位。通过对菌株SY20-2、SY20-4的形态特征、培养特征、生理生化特性、培养条件和拮抗性研究,明确了SY20-2、SY20-4分别属于灰褐类群中的产色链霉菌(Streptomyces chromogenes)和金色类群中的龟裂链霉菌(Streptomyces rimosus)的近源变种。 3、采用种间原生质体融合技术,获得了效价更高、抑菌谱更广的重组菌株。以菌株SY20—2及SY20—4作为出发菌株,利用二者在抗生素抗性上的差异,选择了卡那霉素(250ug/mL)、链霉素(1000ug/mL)和螺红霉素(150ug/mL)作为融合子的筛选标记。明确了出发菌株SY20-2、SY20-4原生质体产生及再生的最佳条件。以45%PEG作助溶剂,初筛原生质体融合频率为1.24%;复筛融合频率为0.124%;最后获得三个广谱、高效的重组菌株。 4、研究明确了菌株SY20-4最佳发酵条件,为凯地菌素进入中试阶段奠定了良好的基础。通过单因子试验,菌株SY20—4利用碳源产素从高到低依次为麦芽糖蔗糖糊精淀粉葡萄糖;利用氮源产素以花生饼粉和黄豆粉为最好,其它依次为玉米粉、酵母粉、蛋白胨、氨水、(NH_4)_2SO_4。通过均匀试验设计,对菌株SY20-4发酵条件的相关方程进行回归分析,其发酵培养基的最佳配方为淀粉3.36%,花生饼粉1.733%,(NH_4)2SO_40.23%,CaCO_30.175%,NaCl0.2%。选用最优化的培养基配方,菌株SY20—4的最佳发酵条件为25℃,150r/min,10%的接种量,起始pH值为4,发酵培养144h,菌株SY20—4产素最多。凯地菌素整个发酵过程中总糖、总氮的含量逐渐减少,但碳源的利用率要明显高于氮源。 5、分离获得了凯地菌素的纯品并明确其类型,确定了凯地菌素为一四烯类新型农用抗生素。采用Doskochilova溶剂系统、pH纸层析和纸电泳, 分析认为凯地菌素属于中性抗生素。选用溶媒革取法和大孔树脂静态吸附法 分离凯地菌素,得到凯地菌素的粗品,采用硅胶层析板法,得到凯地菌素淡 黄色晶体纯品。经高压液相色谱分析,测定提取的凯地菌素纯度可达引%。 将凯地菌素纯品经紫外分析,其吸收峰与典型的四烯类物质吸收峰极为相 近,因此,可初步判断凯地菌素可能为四烯类抗生素。凯地菌素在中性及偏 碱性的条件下稳定,室温条件下存放半年活性开始下降,存放1年其活性丧 失过半;凯地菌素对光稳定,54℃15天凯地菌素的抑菌活性基本与对照相 同。凯地菌素对多种植物病原真菌及细菌都表现显著的抑制效果。采用扩散 法和比色法来估计发酵液中抗生素的效价,认为比色法用来测定凯地菌素的 估计效价是快速准确的,可以在以后的生产上广泛使用。 6、对凯地菌素抗菌作用机制进行了研究。明确了凯地菌素对番茄叶霉 病菌同时具有抑菌和杀菌功能。凯地菌素对叶霉病菌的最小抑菌浓度、最小 杀菌浓度分别为 10fig/ffiL、25fig/ffiL。用凯地菌素处理的叶霉病菌菌丝表面 形成许多瘤状物,同时细胞膜模糊,原生质体外渗。而紫外分光光度法测定 进一步证明了凯地菌素的作用位点在病菌的细胞膜上,从而引起病菌细胞膜 透性增加,引起核酸大分子物质外渗。凯地菌素在ZoUg/ffiL浓度时,即完全 抑制叶霉病菌抱子的萌发。凯地菌素对番茄及番茄叶霉病菌作用的电镜观察 表明,用凯地菌素处理番茄植株,能够使细胞周围沉积大量的电子致密物质, 同时该电子致密物质出现的较接种出现的时间要早且多,同时番茄叶组织内 的菌丝生长迟缓,说明凯地菌素在植物体内也具有抑菌功能:凯地菌素引起 番茄主要防御酶系即超氧化物歧化酶门OD*过氧化氢酶(CAT*多酚氧 化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、p-l,3葡聚 糖酶活性均在喷药后3—7d升高,说明凯地菌素不仅具有直接的杀菌作用, 还可通过诱导植株防御酶系活性的增加而提高植株的抗病性。 7、凯地菌素田间防效试验证明,凯地菌素是一个具有广阔市场前景的 “新型农用抗生素。在离体条件下,凯地菌素的有效中浓度为*hd29.66U针 mL,,。在番茄植株上施药 7d的有效中浓度为 ECto叫4.6ug/mL。在番茄植株上 凯地菌素的有效中浓度明显小于离体条件下的有效中浓度,这与凯地菌素诱 导番茄各防御酶系增强的时间相吻合,进一步说明,喷施凯地菌素能够诱导 番茄抗病性增强。经过凯地酉素与部分
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:TQ450

【引证文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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1 杨燕玲;童村;;顶头孢霉菌原生质体融合研究[J];中国医药工业杂志;1984年01期
2 濮无洪;;应用原生质体融合选育L—苏氨酸和L—赖氨酸产生菌[J];江苏食品与发酵;1988年04期
3 田野;曾西林;袁琰;;用原生质体融合育种技术对啤酒酵母性能的改造及筛选[J];啤酒科技;1999年02期
4 王鑫;车振明;黄韬睿;;原生质体融合技术在微生物菌种选育中的应用[J];食品研究与开发;2008年10期
5 赵玉莲,强学翔,杜兵;面包酵母原生质体融合[J];食品科学;1991年06期
6 张惠玲;吴素萍;;L-苏氨酸产生菌的原生质体融合育种研究[J];中国酿造;2011年07期
7 龙建友;唐世荣;吴文君;;原生质体融合技术对秦岭霉素产量提高的影响[J];中国农业科学;2007年07期
8 常玉广;马放;夏四清;王学江;陈玲;赵建夫;;絮凝菌的细胞融合研究[J];环境工程学报;2008年08期
9 林灯;;原生质体紫外诱变育种[J];发酵科技通讯;2010年03期
10 王宜庆;;细胞融合育种技术综述[J];江苏食品与发酵;1985年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 朱昌雄;谢德龄;粟燕;倪楚芳;;利用原生质体融合技术选育农抗120高产菌株及应用的研究[A];全国生物防治学术讨论会论文集[C];1991年
2 罗红霞;黄彦芳;王芳;孙玉清;王建;;抗酸奶后酸化乳酸菌菌株选育研究进展[A];2009食品科技(北京)论坛会议指南[C];2009年
3 张兴国;陈劲枫;刘佩瑛;李向辉;孙勇如;李文彬;;黄瓜和南瓜原生质体融合得到愈伤组织[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年
4 余志晟;张洪勋;庄绪亮;;运用原生质体融合技术构建内醚糖乙醇发酵菌株的初步研究[A];微生物生态学研究进展——第五届微生物生态学术研讨会论文集[C];2003年
5 金红;贾敬芬;郝建国;;沙打旺与首蓿原生质体融合再生属间体细胞杂种[A];中国细胞生物学学会第八届会员代表大会暨学术大会论文摘要集[C];2003年
6 戴雪梅;黄霞;陈云凤;黄学林;;大蕉与巴西蕉胚性细胞悬浮系的建立及其原生质体融合的研究[A];全国“植物生物技术及其产业化”研讨会论文摘要集[C];2007年
7 夏光敏;陈惠民;;簇毛麦原生质体培养及融合[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年
8 张嫒莉;孟威;刘艳;闫国栋;;蛹虫草原生质体融合高产菌株的筛选[A];吉林省第六届生命科学大型学术报告会论文集[C];2008年
9 郭文武;邓秀新;;体细胞杂交与柑橘遗传改良[A];中国园艺学会第四届青年学术讨论会论文集[C];2000年
10 刘继红;;柑桔生物技术研究进展:原生质体融合和转基因[A];第二届热带亚热带植物资源的遗传多样性与基因发掘利用研讨会论文集[C];2006年
中国重要报纸全文数据库 前4条
1 陈素华 刘占洪;广泛应用于农业的生物技术[N];山东科技报;2002年
2 丁湖广;珍菇松茸的特性及人工驯化栽培技术[N];福建科技报;2006年
3 记者 西林;生物医药欲为京城经济新支点[N];中国企业报;2001年
4 温鲁;食用菌生产技术进展[N];中国绿色时报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 蔡兴奎;原生质体融合创造抗青枯病的马铃薯新种质及其遗传分析[D];华中农业大学;2004年
2 江年琼;三白草和鱼腥草原生质体融合的研究[D];中南林学院;2002年
3 李树;ε-聚赖氨酸产生菌的筛选、育种及发酵研究[D];江南大学;2013年
4 田小群;红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)的诱变和原生质体融合及发酵优化研究[D];华南理工大学;2003年
5 严成其;体细胞杂交创建表达高抗白叶枯病基因的水稻新种质[D];浙江大学;2005年
6 谢志鹏;发酵法生产米多霉素的菌种选育、培养条件优化和动力学研究[D];浙江大学;2005年
7 廖劲松;原生质体融合提高玫瑰茄细胞生长速率的研究[D];华南理工大学;2004年
8 袁玉兰;富铁酵母工程菌的构建及细胞中铁的生物转化、分布和结合状态的研究[D];四川大学;2004年
9 王璐;农杆菌介导转化及原生质体融合法选育红曲菌Monacolin K高产株[D];江南大学;2011年
10 刘焕民;L-缬氨酸高产菌株的选育及其特性的初步研究[D];江南大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 张莉滟;双歧杆菌与乳杆菌原生质体融合的初步研究[D];重庆医科大学;2002年
2 黎永学;双歧杆菌和酿酒酵母原生质体融合的研究[D];重庆医科大学;2002年
3 赵炜;利用原生质体技术选育聚β羟基丁酸高产菌株和发酵条件的研究[D];西北大学;2004年
4 丛国正;原生质体融合技术构建禽霍乱双型链依型菌株[D];甘肃农业大学;2001年
5 牛艳芳;蒙古口蘑与双孢蘑菇原生质体融合育种研究[D];内蒙古师范大学;2004年
6 李建洲;产碱性果胶酶菌株的原生质体融合育种[D];江南大学;2005年
7 刘娟;高产谷胱甘肽优良酵母菌种的选育及发酵条件研究[D];北京化工大学;2003年
8 张慧;缬氨酸生产菌的原生质体融合育种及发酵条件研究[D];天津科技大学;2005年
9 王春平;鸭疫里默氏杆菌和大肠杆菌融合菌株的构建及其双重PCR检测方法的建立[D];山东农业大学;2009年
10 吕聪;紫外诱变与原生质体融合联用选育优势好氧反硝化菌株[D];吉林大学;2008年
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