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库尔勒香梨和葡萄病毒分子检测技术研究

牛建新  
【摘要】:本研究主要包括葡萄病毒RT-PCR 和多重RT-PCR 检测技术、库尔勒香梨RT-PCR 检测技术和多重RT-PCR 检测技术、cDNA 探针检测技术、原位RT-PCR 检测技术等检测体系的建立和优化。 1.以葡萄叶片和皮层为材料,对植物总RNA 和dsRNA 提取方法进行了研究,从中筛选出了适合葡萄总RNA 和dsRNA 的提取方法。建立了GLRaVⅢ和GFLV 的有效RT-PCR 体系,在有效体系基础上,通过研究RT-PCR 主要成分对RT-PCR 的影响,确立了GLRaVⅢ和GFLV 的RT-PCR 的优化体系。在确立葡萄GLRaVⅢ和GFLVRT-PCR 优化体系基础上,研究了多重PCR 的主要成分:dNTPS、Taq DNA 聚合酶、MgCl2对PCR 反应的影响,从而确立了GLRaV Ⅲ、GFLV 的多重RT-PCR 检测体系。 2.以库尔勒香梨叶片和皮层为材料,对7 种总RNA 提取方法进行了研究,从中筛选出了适合库尔勒香梨总RNA 的提取方法。并根据梨组织富含多糖、酚类物质的特点,改进了提取方法。结果表明,要获得良好的RT-PCR 扩增,RT 体系中dNTPs 浓度、互补引物、AMV、模板的浓度要分别达到0.1mmol·L~(-1)、0.2μmol·L~(-1)、0.05U·μL~(-1)、0.01μg·μL~(-1) 以上;此外,使用RNasin能有效抑制RT 体系中RNase 对病毒RNA 的降解作用,可使RT 过程顺利进行;PCR 体系中dNTPs 浓度至少要达到0.1mmol·L~(-1),0.2~0.3mmol·L~(-1)可以获得最佳的扩增效果;Taq E 浓度要达到0.015U·μL~(-1)以上;引物浓度适宜范围0.3~0.7μmol·L~(-1);Mg~(2+)要达到1.26mmol·L~(-1)以上。 3.利用nad5 基因作为内标系统,研究建立了库尔勒香梨上ASPV、ACLSV、ASGV 等病毒的RT-PCR 检测技术,在此基础上研究建立了库尔勒香梨多重RT-PCR 内标检测系统。并对回收的特异片段进行了克隆、鉴定和测序。


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