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《沈阳农业大学》 2007年
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中国结核分枝杆菌临床分离株异烟肼耐药基因突变特征的初步研究

朱艳伶  
【摘要】: 近年来,结核病的疫情呈现重新上升的趋势。引起全球结核感染疫情回升的主要因素之一是耐药结核分枝杆菌,尤其是耐多药结核分枝杆菌的出现及其引起疾病的流行。我国结核的耐药情况尤为严峻,总耐药率为27.8%,耐多药率高达10.7%,由此而造成的结核病患病率和死亡率居高不下。因此,快速准确的检测结核分枝杆菌耐药性成为结核病防治工作的当务之急,是制定恰当的化疗方案的重要依据。 异烟肼(Isoniazid,INH)是最有效的抗结核药物之一。随着分子生物学技术的发展,异烟肼耐药机制的逐步明了,现已证实结核分枝杆菌异烟肼耐药主要与katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahpC等基因突变有关。 为了深入了解我国结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因突变情况,明确其突变位点的分布、主要突变位点及其发生率,本研究从西藏、湖南、河南、四川、福建、安徽和陕西七省收集结核分枝杆菌临床分离菌株,首先对其采用生化反应方法进行菌种鉴定并用比例法进行药物敏感性试验,其后用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahpC等基因,进行DNA测序分析,根据检测结果分析基因突变类型及与耐药之间的关系,并分析统计发生突变的各位点的突变率。 我们共收集到536株分枝杆菌临床分离株,用鉴别培养基进行了菌种鉴定,89.93%为结核分枝杆菌,3.54%为牛分枝杆菌,6.16%为非结核分枝杆菌,0.37%为结核分枝杆菌加非结核分枝杆菌的混合感染。 采用比例法对482株结核分枝杆菌进行药物敏感性试验,对四种抗结核一线药物(SM,RFP,INH,EMB)和一种二线药物(PAS)全部敏感的菌株为118株,占全部被测菌株的24.48%;耐药菌株364株,占全部被测菌株的75.52%,其中,单耐药菌株88株,占18.26%;多耐药菌株276株,占57.26%。 针对结核分枝杆菌异烟肼耐药的相关基因katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahpC设计引物,应用聚合酶链反应和DNA序列分析对结核分枝杆菌标准株H_(37)Rv及291株临床分离菌株,包括全敏感株64株,异烟肼相对敏感株48株,异烟肼单耐药株30株,联合耐药株149株进行耐药基因突变检测。 测序分析结果显示:(1)179株异烟肼耐药菌株中,163株发现耐药基因“热点突变区”突变,112株INH敏感株中有3株发生KatG基因的突变。与常规药敏试验比例法比较,DNA测序法检测的灵敏度为91.06%(163/179),特异度为97.32%(109/112),阳性预测值98.19%(163/166),阴性预测值87.20%(109/125),符合度为93.47%(272/291),两种方法检测的结果之间的差异无统计学意义(x~2=7.58,P>0.05)。(2)179株异烟肼耐药菌株中,463位点发生突变的有129株,占72.07%,112株异烟肼敏感株中,463位点发生突变的有74株,占66.07%,耐药株和敏感株间的突变率差异无统计学意义(x~2=1.1739,P>0.05),证实INH耐药与Arg463Leu突变无相关性。(3)在179株异烟肼耐药菌株中,138株(77.09%)异烟肼耐药株katG存在点突变,其中7个位点尚未见报道,131株(73.18%)耐药株第315位点突变,涉及4种突变类型,但主要是AGC(Ser)→ACC(Thr)的突变,共123株,占这个位点突变的93.89%。未发现katG的缺失与插入。(4)1株(0.56%)耐药株inhA发生突变,敏感株中未检测到突变。(5)18株(10.06%)耐药株oxyR-ahpC基因连接区发生点突变,其中7株发生-9C→T的突变,占突变的3.39%,另有3株发生-5G→A的突变,3株发生-14C→T的突变等;敏感株中未检测到突变。(6)3株(1.68%)耐药株ndh存在点突变,突变类型为第191位点的GAG(Glu)→GGG(Gly),敏感株中未检测到突变。(7)检测179株耐药菌株的pre-inhA基因,-15C→T的突变有12株,占6.67%,其中9株发生的是单点突变而没有其他位点及其他相关基因突变,其他的突变还见于-19G→A、-8T→C、13G→C,敏感株中未检测到突变。(8)在全部菌株中未发现oxyR和ahpC基因突变。(9)综合本试验中各基因的变化情况,共有163株耐异烟肼菌株发生与异烟肼表型耐药相关的突变。 本项研究进一步证实了结核分枝杆菌耐异烟肼与katG、pre-inhA、inhA、ndh及oxyR-ahpC基因突变之间的关系,为下一步耐药芯片的探针设计打下了基础,同时也提示了还有其他的机制参与了异烟肼耐药。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S852.61

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【参考文献】
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