收藏本站
《沈阳农业大学》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

原生质体融合曲霉菌株β-葡萄糖苷酶的酶学性质及对葡萄酒增香调控作用的研究

朱凤妹  
【摘要】: β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,EC.3.2.1.21)全称β-D-葡萄糖苷水解酶,是纤维素酶系的一个组成部分。它能酶解键合态的风味前体物质,释放出香气成分。本实验对高产β-葡萄糖苷酶菌株黑曲霉(Aspergillus.niger)和米曲霉(Aspergillus.oryzae)进行原生质体融合育种、发酵条件优化、β-葡萄糖菅酶分离及动力学性质进行研究,结合Kramer感官评定法和气相色谱-质谱(GC-MS)法对其在葡萄酒增香中的作用进行研究。主要研究内容和结果如下: 1.对米曲霉3.481、米曲霉3.483、米曲霉L、黑曲霉3.316、黑曲霉3.4523、黑曲霉L1、黑曲霉L2菌株进行初筛,以β-葡萄糖苷酶活力为筛选指标进行比较,确定黑曲霉3.316和米曲霉3.481为出发菌株。。 2.优化黑曲霉3.316原生质体和米曲霉3.481原生质体形成和再生的条件。黑曲霉3.316原生质体形成和再生的最适条件:菌龄为对数生长中期60h,0.6M氯化钠/0.01M磷酸缓冲溶液为渗透压稳定剂,0.2%L-半胱氨酸为脱壁促进剂,1.0%的纤维素酶和蜗牛酶(1:2,V/V)30℃水浴酶解4h。米曲霉3.481原生质体形成和再生的最适条件:菌龄为对数生长早期48h,0.6M氯化钠/0.01M磷酸缓冲溶液为渗透压稳定剂,0.1%L-半胱氨酸为脱壁促进剂,1.5%纤维素酶和蜗牛酶(1:1,V/V)30℃水浴酶解3h。 3.黑曲霉3.316原生质体紫外灭活条件:紫外灯20W,垂直距离15cm,磁力搅拌3min灭活,原生质体存活再生率为0。米曲霉3.481原生质体热灭活条件:60℃水浴30min灭活,原生质体存活再生率为0。采用35%聚乙二醇(PEG)4000做为促融合剂,0.1mmol/LCaCl_2,30℃,融合30min。融合子经过初筛、复筛、再复筛得到一株产酶活力高、遗传稳定的菌株。 4.通过单因素试验、Box-Benhnken中心组合试验和响应面分析试验对融合菌株的发酵培养基进行优化,确定其最佳培养基条件为:麸皮+淀粉浓度9.19%、硫酸铵浓度0.59%、pH4.78、CaCl_2浓度0.02%、KCl浓度0.04%。 通过正交交互试验确定融合菌株产β-葡萄糖苷酶的发酵条件:装液量20mL/250mL,接种量12%,发酵温度27℃,摇床转速180r/min。最佳发酵时间:7d。 5.对β-葡萄糖苷酶进行分离纯化。利用饱和度为60%~90%的硫酸铵对β-葡萄糖苷酶进行盐析,去除大部分杂蛋白。硫酸铵盐析浓缩后酶液经过DE-22纤维素离子交换柱层析,纯化倍数为1.73倍,比活力为3.71U/mg;交联葡聚糖Sephadex G-150凝胶柱层析,纯化倍数达138.85倍,比活力为297.14U/mg,经PAGE电泳检测为1条谱带,达到电泳纯。SDS-PAGE电泳测定其亚基分子量为125kD左右。 6.对纯化后β-葡萄糖菅酶的酶学进行研究。结果表明:β-葡萄糖苷酶的最适温度65℃,最适pH5.4,在pH3.0~6.6条件下较稳定,热稳定性较好。Na~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)、K~+、EDTA对β-葡萄糖苷酶活力有明显抑制作用,Fe~(3+)对酶活力有促进作用。β-葡萄糖苷酶的动力学方程为:1/V=0.0201×1/[S]+0.5809,Vmax=1.7215μmol/min,米氏常数Km=0.03 5mmol/L。 7.采用Amberlite XAD-2大孔吸附树脂吸附葡萄酒中游离态芳香物质,戊烷:乙醚(1:1,V/V)做为溶剂具有较好的洗脱效果。 利用β-葡萄糖苷酶酶解葡萄酒中分离出的键合态物质,将键合态呈香物质酶解前后进行HPLC分析。结果显示:键合态物质在酶解后出现了鼠李糖、木糖、葡萄糖。并且键合态物质在酶解后出现葡萄酒特有的香气。 将葡萄酒中游离态芳香物质和键合态呈香物质酶解得到的芳香物质经过GC-MS分析。结果表明:键合态的芳香物质经过β-葡萄糖苷酶酶解后释放出许多芳香物质,如甲酸异戊酯、苯乙烷、3-戊醇、正己醇、异戊酸、乙酸异戊酯、丁内酯、丁醇、2-甲基-丁酸、α-蒎烯、己酸、苦杏仁油、苄醇、苯乙醛、己酸乙酯、苯乙醇、乙酸-2-苯乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、丙酸-2-苯乙酯、月桂酸乙酯、邻苯二甲酸二丁酯等,这些物质有典型的香气,对葡萄酒的香味有一定的增强作用。 8.L_9(3~4)正交试验设计通过Kramer感官评定,确定葡萄酒酶解增香综合影响因素的顺序为:酶解温度>酶量>酶解时间。酶解最佳条件为:酶解温度45℃、酶解时间90min、加酶量8mL/100mL葡萄酒。 利用水蒸气蒸馏β-葡萄糖苷酶酶解的葡萄酒和对照未处理的葡萄酒,经GC-MS分析发现酶解后出现更多的香气成分,主要包括:甲酸异戊酯、3-戊醇、糠醛、异戊酸、2-甲基-丁酸、3-羟基-丁酸乙酯、己酸、己酸乙酯、苄醇、辛酸、辛酸乙酯、月桂酸乙酯等。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:TS262.6

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 闻雅男;赵娜;滕雪莹;王学英;;黑曲霉植酸酶高产菌株产酶条件的筛选[J];辽宁农业科学;2011年03期
2 黄时海;曹喜秀;何鑫平;冯国芳;黄飞;康超;吴孔阳;曹普美;李湘萍;;发酵法制备马铃薯微孔淀粉技术研究[J];中国酿造;2011年07期
3 郭艳;;紫外线诱变黑曲霉提高产酶活力的研究(英文)[J];Agricultural Science & Technology;2011年07期
4 徐新丽;;原生质体融合技术选育纤维素发酵产油菌株[J];武夷学院学报;2011年02期
5 岳磊;林琼妹;许格;林磊;石贤爱;;含离子液体介质中酶催化糖基化合成4-羟基苯乙基β-D-葡萄糖苷[J];分子催化;2011年03期
6 李祝;刘吴娟;葛永怡;陈青;周礼红;;黑曲霉单孢子株的分离及其性状[J];山地农业生物学报;2011年03期
7 韩天龙;王敏;赵瑞霞;照日格图;李志明;;产纤维素酶系黑曲霉的二次活化与传代培养研究[J];饲料研究;2011年07期
8 梁新红;孙俊良;唐玉;郭祖峰;;黑曲霉糖化酶分离纯化与酶学性质研究[J];河南科技学院学报(自然科学版);2011年04期
9 陈桂光;李玮;齐辉连;张云开;梁智群;;黑曲霉低聚异麦芽糖高产菌株的诱变选育[J];食品工业科技;2011年08期
10 马如意;赵祥颖;刘建军;;单宁酶产生菌的发酵培养基优化[J];中国酿造;2011年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘小杰;何国庆;陈启和;倪辉;;黑曲霉β-葡萄糖苷酶发酵培养基的优化[A];中国食品科学技术学会第五届年会暨第四届东西方食品业高层论坛论文摘要集[C];2007年
2 孟宪文;宋小红;陈历俊;刘长江;;β-葡萄糖苷酶的研究进展[A];中国奶业协会年会论文集2009(下册)[C];2009年
3 蔡亚楠;郁彩虹;高裙裙;张琦;张耀东;;木犀草素和β-葡萄糖苷酶相互作用的荧光光谱法研究[A];中国化学会第十届全国发光分析学术研讨会论文集[C];2011年
4 赵伯涛;钱骅;陆伟;张卫明;;β-葡萄糖苷酶水解栀子苷研究[A];第九届全国药用植物及植物药学术研讨会论文集[C];2010年
5 李宁;陈磊;宗敏华;;一种来源于西梅籽的耐受葡萄糖的β-葡萄糖苷酶的分离纯化[A];2010年中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会学术年会暨华南地区农产品加工产学研研讨会论文摘要集[C];2010年
6 杨欣伟;柯崇榕;吴松刚;黄建忠;;黑曲霉EIM-6果胶裂解酶基因的克隆与表达[A];华东六省一市生物化学与分子生物学会2009年学术交流会论文摘要汇编[C];2009年
7 谢必峰;王水顺;;黑曲霉SL2-111酸性蛋白酶的纯化及其酶学特性[A];2004年全国生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
8 叶明;;黑曲霉发酵泔水生产饲料蛋白的研究[A];第五次全国土壤生物和生物化学学术研讨会论文集[C];2009年
9 陈颖;;G915黑曲霉生产果胶酶动力学研究[A];'96全国方便食品加工与包装技术交流会论文集[C];1996年
10 张金祥;李颖;毛志辉;袁红莉;王华明;王敖全;唐国敏;;黑曲霉ku80基因的缺失可显著提高DNA的同源重组频率[A];第八届海峡两岸菌物学学术研讨会论文集[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 施慧;帝斯曼公布黑曲霉基因组DNA序列[N];中国化工报;2007年
2 中国WTO TBT-SPS中心供稿;加拿大修改食品生产中使用菌黑曲霉和派生磷脂酶临时营销许可[N];中国国门时报;2009年
3 ;青贮饲料时如何促进乳酸发酵[N];中国畜牧兽医报;2008年
4 ;蛋白酶[N];中国畜牧兽医报;2008年
5 广东省农科院植保所 王璧生 刘景梅 研究员;芒果病虫害的防治[N];广东科技报;2003年
6 王利华;石头也治病[N];医药养生保健报;2007年
7 中国农业大学 陆文清博士;评价饲料酶质量的5种指标[N];中国畜牧报;2005年
8 于峰;精美的石头能治病[N];中国中医药报;2006年
9 刘捷;铜:“超级病毒”的终结者[N];中国有色金属报;2007年
10 吴敏 杨政水;生物制剂在肉类加工中的应用[N];中国食品质量报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 钱利纯;高效水解大豆异黄酮β-葡萄糖苷酶及其对肉公鸡生产性能的影响研究[D];浙江大学;2008年
2 潘利华;大豆异黄酮糖苷的超临界流体萃取及固定化酶转化研究[D];合肥工业大学;2009年
3 朱凤妹;原生质体融合曲霉菌株β-葡萄糖苷酶的酶学性质及对葡萄酒增香调控作用的研究[D];沈阳农业大学;2008年
4 张益波;新型β-葡萄糖苷酶菌株syzx4筛选、发酵及酶纯化表征和应用[D];吉林大学;2011年
5 吴鹏;基因重组酒香酵母菌株高产β-葡萄糖苷酶的高密度液态发酵模型及酶学性质研究[D];华中农业大学;2012年
6 赵林果;β-葡萄糖苷酶的制备与回收利用及其基因的克隆表达[D];南京林业大学;2007年
7 周庆新;木霉纤维素膨胀因子Swollenin与β-葡萄糖苷酶的功能研究[D];山东大学;2011年
8 李兆周;贯叶连翘中金丝桃素的酶辅助提取与微波辅助合成研究[D];中国农业科学院;2011年
9 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
10 朱汇源;木聚糖诱导条件下黑曲霉特异基因表达分析及高表达碱性木聚糖酶产黄青霉菌株构建研究[D];山东大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 欧杰;交联β-葡萄糖苷酶聚集体的制备及其生产大豆异黄酮活性苷元的研究[D];合肥工业大学;2007年
2 倪浩;黑曲霉内、外切葡聚糖酶基因的克隆与表达[D];南京林业大学;2010年
3 马腾;高产耐热β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株选育及其基因克隆[D];河北科技师范学院;2012年
4 郭慧女;β-葡萄糖苷酶生产菌的选育及其对葡萄酒中结合态香气的影响[D];江南大学;2010年
5 王茜;黑曲霉β-葡萄糖苷酶产酶条件的优化及初步应用研究[D];海南大学;2011年
6 徐升;黑曲霉B_1降解有机磷农药氧乐果的特性研究[D];福州大学;2004年
7 张卫兵;高产植酸酶菌株的选育和培养条件的研究[D];西北大学;2004年
8 肖长清;生淀粉糖化酶产生菌的分离筛选及其产酶条件[D];中国科学院研究生院(成都生物研究所);2005年
9 顾宇峰;果蔬加工用软化酶的研究[D];江南大学;2005年
10 李加强;黑曲霉产木聚糖酶液体发酵工艺的研究[D];华中农业大学;2003年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026