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树莓种质资源遗传多样性及创新研究

李媛媛  
【摘要】: 本研究以树莓属植物资源为试材,探索建立并优化树莓的RAPD分析体系和SSR分析体系,在此基础上,利用这两种分子标记技术分析了沈阳农业大学树莓资源圃保存的101份树莓属植物资源的遗传多样性。同时进行了树莓叶片离体再生体系建立和多倍体诱导的研究。主要结果如下: 1.改进的CTAB法(提取缓冲液中含3%的CTAB)和TIANGEN试剂盒法是适宜的树莓总DNA提取方法。改进CTAB法提取的树莓总DNA的产率较低,但是纯度较高,OD_(260)/OD_(280)比值在1.729~1.911之间;TIANGEN试剂盒法提取的树莓总DNA的产率和纯度均较高,OD_(260)/OD_(280)比值在1.727~1.901之间。以上述两种方法提取的树莓总DNA为模板进行RAPD和SSR扩增,能扩增出多条清晰的谱带,多态性、稳定性、重复性良好。 2.对反应体系中dNTP的种类和浓度、DNA模板浓度、Taq DNA聚合酶的种类和浓度、Mg~(2+)浓度、不同公司的PCR Buffer和Mg~(2+),以及循环次数等多个影响RAPD反应结果的因子进行了研究,建立了优化的树莓属植物RAPD分析体系,即:PCR反应体积为20μl,内含1×PCR反应缓冲液,2.0 mmol/L MgCl_2,0.2 mmol/L dNTP,0.3μmol/L引物,0.5 U Taq DNA聚合酶,50 ng树莓总DNA;扩增程序为93℃2 min;93℃1 min,35℃1 min,72℃2 min,42个循环;72℃5 min。根据谱带数目、多态性和清晰度,从100个A系列RAPD引物中筛选出16个适宜于树莓属植物遗传分析的引物。 3.对反应体系中Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶浓度、DNA模板浓度及退火温度和循环次数等影响SSR反应结果的因子进行了研究,建立了优化的树莓属植物SSR分析体系,即:PCR反应体积为15μl,内含1×PCR反应缓冲液,0.9 mmol/L MgCl_2,0.25 mmol/L dNTP,引物各0.2μmol/L,0.5 U Taq DNA聚合酶,60ng总DNA;扩增程序为扩增程序为:95℃5 min;95℃45 s,50~66.5℃45 s,72℃45 s,30个循环;72℃延伸5 min。根据谱带数目、多态性和清晰度,从60对SSR引物中筛选出38对适宜于树莓属植物遗传分析的引物。 4.回收了50个树莓RAPD多态性谱带,然后对其进行克隆和测序,共获得了27个不同的树莓基因组序列。基于解析的树莓序列设计特异引物,成功地将16个RAPD标记转化成SCAR标记。 5.利用分子标记技术对树莓属植物资源进行遗传多样性研究,用16个RAPD引物在101份树莓属植物资源上共检测到207个多态性位点,不同树莓种质资源之间的相异系数在0~0.73之间,UPGMA法聚类分析结果显示不同树莓种质资源之间距离系数在0~0.63之间;用38对SSR引物在101份树莓属植物资源上共检测到241个等位变异,Shannon遗传多样性指数范围为0.0953~0.8591,平均值是0.6324。不同树莓种质资源之间的相异系数在0~0.86之间,UPGMA法聚类分析结果显示不同树莓种质资源之间距离系数在0~0.74之间,表明树莓属植物存在较高的遗传多样性。 6.分别绘制了基于RAPD标记和基于SSR标记的树莓属植物分子系统进化树,聚类结果基本一致。表明两种标记技术都适合于树莓属植物的种内、种间的遗传变异分析。 7.系统地进行了树莓叶片离体再生的研究,以红树莓品种‘秋福'(Rubus L.AutumnBliss)离体叶片为外植体,接种于MS+TDZ 2.00 mg/L+IAA 0.10 mg/L的培养基,暗培养2~3周后转移至正常光照下培养,愈伤组织形成率、不定芽再生率和外植体不定芽数分别为100.00%、95.83%和5.57±0.27个。将再生芽接种于1/2 MS+IBA 0.10mg/L的培养基中,35 d后生根率达100.00%。 8.用含秋水仙碱45 mg/L的固体培养基处理‘秋福'树莓叶片8 d后,转移至正常叶片再生培养基上处理3周,将再生的不定芽在成苗培养基(MS+0.5 mg/L BA+0.2mg/L IAA+1.0 mg/L GA)上培养40 d左右分化成苗。通过观察染色体数目对再生植株进行倍性鉴定,20个检测植株中有5株是四倍体,四倍体诱导率高达25%。


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