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《沈阳农业大学》 2009年
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平邑甜茶(Malus hupehensis var. pingyiensis)的杂交后代生殖特性研究和花期子房抑制性消减文库构建

王颖  
【摘要】: 本文以平邑甜茶与扎矮山定子杂交后代中6个皱叶矮生型株系(8~#、10~#、14~#、15~#、28~#、42~#)为试材,以两个亲本为对照,观察了各类试材的开花坐果习性,对其无融合生殖能力进行了比较;利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)和石蜡切片技术对其胚胎发育过程及发育特性进行了观察与研究,全面系统地研究了各类试材的生殖方式和生殖特性;为了确定平邑甜茶杂交后代的倍性特征和核型特点,采用压片和流式细胞仪观测的方法对平邑甜茶与扎矮山定子杂交后代中的4个皱叶矮生型株系(10~#、14~#、15~#、28~#),一个光叶型株系,及两组4株平邑甜茶双胚苗进行了染色体倍性鉴定和核型分析,探讨了试材间可能的进化趋势和亲缘关系;以胚胎学观察为基础,确定了平邑甜茶无融合生殖发生的时期,构建了平邑甜茶花期子房的消减cDNA文库,并对通过差异筛选消减文库所获得的差异基因片段进行了序列和同源性分析。本研究为今后克隆平邑甜茶无融合生殖相关基因以及果树基因工程奠定了基础,为丰富苹果属无融合生殖资源并揭示平邑甜茶无融合生殖性状的遗传机理提供了胚胎学、细胞学和分子生物学方面的参考依据。 研究结果如下: 1.皱叶矮生型株系均表现为无花粉;坐果率及单果结籽数都低于母本平邑甜茶,但株间变化较大;平均单果重为:扎矮山定子<皱叶矮生型株系<平邑甜茶;对皱叶矮生型株系进行切柱头处理后,它们的结果率均明显下降,采果率均小于20%,远远低于母本平邑甜茶的84.1%;单果种子数低于自然授粉的单果种子数,说明皱叶矮生型株系虽然具有一定的无融合生殖能力,但程度很低。 2.各皱叶矮生型株系在胚胎发育过程中表现出的特征大体相同,能进行正常的减数分裂并由功能性大孢子形成的有性胚囊表现出良好的发育趋势;在开花当天至花后2d,为八核胚囊形成期,各株系的胚囊中均出现了精核或花粉内容物,观察到了部分株系的受精卵;在花后10d左右原胚形成;另外,在胚囊发育的特定时期,胚囊内细胞核的分布方式各株系间略有差异,在部分株系中观察到了少数多胚囊现象。综合而言,皱叶矮生型株系的胚胎发育特征是以有性生殖为主的生殖方式,与亲本扎矮山定子的胚胎发育特征较为一致;与亲本平邑甜茶不同,未出现平邑甜茶胚胎发育中复杂的现象并表现出较弱的无融合生殖能力。 3.经鉴定平邑甜茶双胚苗2组(8-1、8-2;12-1、12-2)均为三倍体;平邑甜茶与扎矮山定子杂交后代中4个皱叶矮生型株系(10~#、14~#、15~#、28~#)均为四倍体;光叶型株系的染色体为非整倍体,2n=43。各类试材染色体的共同核型特点是:染色体为小型,染色体长度比(最长/最短)变动在2的上下,差异不大;核型组成由中部着丝点染色体(m)和亚中部着丝点染色体(sm)组成,而各类核型均表现在此基础上的不同程度的差异。本研究中各试材涉及1A,2A,1B和2B四类核型。 4.以平邑甜茶开花当天(tester)和开花前1d(driver)的子房为材料,采用抑制性差减杂交(SSH)技术构建了平邑甜茶花期子房消减cDNA文库。通过对文库构建中关键环节,包括总RNA及起始mRNA质量、接头连接效率、差减效率等方面的控制,使构建的文库质量较好,经过蓝白斑筛选后,共挑取白色克隆768个,利用PCR法检测片段插入载体的情况,可以观察到插入片段大小分布在250~1200 bp范围内,结果符合建库要求,为高效筛选差异表达基因奠定了基础。 5.通过斑点杂交差异筛选消减cDNA文库获得304个阳性克隆,304个阳性克隆经测序后共获得114个有效表达序列标签(EST)。通过与GenBank中的序列进行BLAST比对分析,功能注释和分类后获得85条已知功能序列,其余的29个唯一序列与其它物种同源性较低,可能代表新基因或者变异度较高的cDNA非编码区序列。这85条已知基因的ESTs的生物学功能涉及基础代谢、蛋白代谢、金属转运、膜蛋白、胁迫应答、转录因子等,这说明平邑甜茶在这一时期的ESTs所代表的基因参与到了植物细胞生命活动的许多方面。 6.对EST序列分析表明所构建的消减文库中的确包含一些与植物无融合生殖相关的一些cDNA克隆。发现泛素(Contig13)、半胱氨酸蛋白酶(B20)、衰老相关基因(A21)等涉及到与细胞程序性死亡(programmed cell death)相关的基因。进一步证实了在平邑甜茶开花前后1d发生了有性胚囊败育,而无性胚囊开始发育这一重要现象,验证了平邑甜茶兼性无融合生殖的特点。在平邑甜茶开花前1d的子房中发现的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶(B26)、S-腺苷甲硫氨酸甲基转移酶(B70)、丙二烯氧化合酶(B38)、乙烯受体(B96)、细胞色素P450酶(B58)、甲硫氨酸合酶(B77)等相似基因片段与植物体内的生长素有关,将会参与乙烯、多胺、茉莉酸、赤霉素等的代谢途径,与植物的成熟和衰老具有密切的关系。说明平邑甜茶的无性胚囊的发育和有性胚囊的败育是通过多种途径来实现的,是多基因协同作用的结果。
【学位授予单位】:沈阳农业大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S661.1

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