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热加工食品和水产品中致病菌检测技术体系建立

郑秋月  
【摘要】: 热加工食品和水产品中多种致病菌是威胁人类食品安全和身体健康的重要因素。目前国内外对热加工食品和水产品中致病菌的检测方法还多停留在检测效率低、目标单一的水平上。本研究采用DNA聚合酶链反应(PCR)结合变性高效液相色谱(denaturing highperformance liquid chromatography,DHPLC)高通量核酸检测方法,对热加工食品和水产品中多种致病菌的高通量检测、快速分种、毒素编码基因筛选、致病菌突变株检测等高通量检测技术进行了系统研究,搭建相应技术平台,获得了以下试验结果: 1、在国内外首次应用多重PCR结合DHPLC在非变性条件下分离DNA片段的原理,通过优化多重PCR和DHPLC分析条件,建立了针对热加工食品中常见的蜡样芽胞杆菌、肉毒梭状芽胞杆菌、产气荚膜梭状芽胞杆菌等3种芽胞菌及其毒素编码基因的DHPLC高通量检测技术;在国内外首次建立了PCR-DHPLC非变性条件检测热加工食品中致病菌的特异性基因检测平台。弥补了芽胞菌检测因普通培养鉴定周期长、试剂质量和生化反应不稳定而导致的误检、漏检等问题。 2、在国内外首先进行了通用引物PCR-DHPLC非变性条件下,乳酸杆菌属检测方法的研究,解决了热加工食品中常见的乳酸杆菌属PCR-DHPLC法高通量检测技术难题,建立了乳酸杆菌属的PCR-DHPLC快速检测技术。为在食品安全和工业生产检测中对乳酸杆菌属的快速检测提供了科学、高效、快捷的检测手段。 3、解决了乳酸杆菌属的各个菌种间凭借DNA序列碱基差异而达到分类鉴别的高通量分种鉴定技术难题。采用DHPLC部分变性条件下分型鉴定方法,在国内外首先建立了乳酸杆菌属9个分类菌种的高通量分种鉴定方法,真正达到了一次增菌、一次检测,即可同时鉴别乳酸杆菌属9个分类菌种的分种鉴定的科学、高效、快捷的鉴定目的。部分变性条件下DHPLC检测乳酸杆菌9个菌种分型鉴定方法具有创新性。 4、本研究应用多重PCR结合DHPLC,解决了水产品中多种常见致病菌高通量快速检测技术难题,建立了从多种目标菌一次复合增菌、一次PCR-DHPLC完成检测的快速检测技术。以水产品中常见致病菌,霍乱弧菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、肠出血性大肠埃希氏菌0157:H7、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌等9种致病菌为研究对象,进行非变性条件下的九重PCR-DHPLC检测技术研究。在国内外首次建立了多重PCR-DHPLC非变性条件下,检测水产品中9种致病菌的高通量检测方法,建立了PCR-DHPLC检测水产品中致病菌的特异性基因检测平台。并进行了霍乱弧菌突变株的筛选检测,在进行水样检测时,分离并鉴定出霍乱弧菌突变株。 本研究成果实现了在一次操作过程中同时检测水产品中9种致病菌,使得致病菌的检测时间、检测数量和检测水平发生了很大的飞跃,从而达到对水产品中上述9种致病菌快速、准确、高灵敏检测的目的。 综上所述,本课题在国内外首次建立了热加工食品和水产品中多种致病菌的DHPLC精准、高通量检测技术,细菌快速分种鉴定技术,毒素编码基因筛选技术。并使其检测技术标准化,在研究成果基础上,制定了中华人民共和国出入境检验检疫行业标准;而且研究成果已经转化为检测试剂盒,申报了国家发明专利,具有重要的研究意义和应用价值。


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