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《大连海洋大学》 2016年
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红鳍东方鲀amhrⅡ和amh基因的表达研究及性腺转录组的初步研究

高长富  
【摘要】:抗苗勒氏管激素(anti-müllerian hormone,AMH)是一种糖蛋白激素,属于β-转化生长因子(TGF-β)超家族。Amh基因能够在雄性哺乳动物性腺分化期,抑制缪勒氏管的形成,从而抑制雌性生殖器官的发育。它作为一个重要的性别分化因子,能够调节生殖细胞的发育及分化。抗苗勒氏管激素二型受体(anti-müllerian hormone type II receptor,AMHRII)也是转化生长因子β受体超家族的成员,它与配体AMH结合后,通过细胞内的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域起作用。为了研究amh和amhrII基因在红鳍东方鲀各组织和不同发育时期的表达情况,进而研究amh和amhrII基因在红鳍东方鲀性别分化和性腺发育等过程中的作用。本实验利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术分析amh和amhrII基因在红鳍东方鲀成鱼的肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等不同组织,以及23、30、40、60、80日龄及2龄和3龄,7个发育时期个体水平上的表达情况。结果显示:红鳍东方鲀amh基因在脾脏中的表达量最高,其次是肾脏、肝脏和精巢,在卵巢和脑中的表达量较低,并且精巢中的表达量大约是卵巢中的2倍;23日龄、30日龄、2龄和3龄雄鱼amh基因的表达量极显著高于同时期的雌鱼的表达量(P0.01),在60日龄和80日龄时雌鱼表达量高于雄鱼,40日龄雌雄鱼的表达量无显著性差异;在雄性红鳍东方鲀不同发育时期中,23日龄到30日龄amh基因的表达量升高到最大值,到2龄期间呈现降低的趋势并到达最低值,再往后又有所回升。雌鱼整体呈现先增长后降低的趋势,80日龄时amh基因表达量最高。从以上数据可以推断,amh基因在红鳍东方鲀卵巢分化过程中发挥着一定的作用。红鳍东方鲀amhrII在卵巢中的表达量最高,大约是精巢的40倍,脑和肝脏等组织中表达量很低,精巢和卵巢中amhrII的表达量极显著高于其他组织(P0.01)。对于不同发育时期的个体而言,amhrII在3龄雌雄成鱼中的表达量都极显著高于各时期(23、30、40、60和80日龄)的幼鱼,而且卵巢中的表达量极显著高于精巢(P0.01)。雌性个体,23、30和40日龄时期amhrII的表达量很低,而60日龄时表达量迅速升高,80日龄时表达量急剧下降,雄性幼鱼各时期amhrII的表达量都很低。以上数据可以为研究amhrII在红鳍东方鲀精巢分化,性腺发育以及生殖细胞形成过程中起到的作用提供参考。本实验基于RNA-seq技术以3龄红鳍东方鲀成年鱼的精巢和卵巢组织为材料,进行转录组测序分析,通过原始数据筛选过滤在精巢与卵巢分别得到38464975和36092955条比对到红鳍东方鲀基因组数据库上的reads。在精巢和卵巢两个组织中总共有21468个基因得到KEGG Pathway的注释,共涉及39个代谢途径,这些代谢途径总共分为6大类。每条通路中都含有差异表达基因(DE gene),其中含基因最多的2项为Signal transduction和Infectious diseases。另外,过滤后通过Varscan获取在染色体上所有可能的SNP位点信息,在精巢和卵巢样本中分别发现23879和55675个cSNPs,通过对样品间差异cSNP统计得到在精巢和卵巢中共有的cSNP 9553个,而精巢中特有的cSNP 14326个,卵巢中特有的cSNP 46122个。通过HTSeq统计比对到基因上的数值,然后通过DESeq分析差异表达基因,最后按照表达量倍数差异和表达差异显著性p-value筛选出差异基因,共鉴定出680个差异表达基因,其中在卵巢中高表达基因有124个,556个基因在精巢中高表达。选取了agrp1、sstr2、foxn4(雄性高表达)和gdf3、gdf15(雌性高表达)5个差异表达基因,以三龄鱼为模板通过qRT-PCR验证转录组测序结果的准确性,qRT-PCR的结果与RNA测序结果基本一致,表明转录组序列的表达分析比较可靠。另外,利用qRT-PCR技术研究各基因在红鳍东方鲀不同发育时期的表达情况发现:(1)在红鳍东方鲀卵巢分化的关键时期(35日龄左右)agrp1在精巢和卵巢中同时高表达,精巢中的表达量大约是卵巢的48倍,可能参与红鳍东方鲀的卵巢分化过程。(2)红鳍东方鲀sstr2基因主要在23日龄、40日龄幼鱼两性性腺中表达,且不同发育时期精巢中的表达量都高于卵巢,40日龄时表达量最高。由此可以推测,sstr2基因在红鳍东方鲀的卵巢分化过程中起重要作用。(3)foxn4基因只在成鱼中表达,而且雄性个体中表达量较高,foxn4基因参与红鳍东方鲀精巢和卵巢的发育过程。(4)对于红鳍东方鲀雌性个体而言,在整个发育时期gdf3持续表达,80日龄以前gdf3的表达量较低,3龄鱼卵巢表达量最高,而雄性个体中只出现在成鱼中。以此可以看出,gdf3参与红鳍东方鲀性腺发育和卵细胞的形成过程,而且在卵巢维持中也可能起到一定作用。(5)gdf15在雌雄红鳍东方鲀的不同发育时期都有表达,40日龄时的表达量最多,大约是雌性的6倍,其他时期的表达量都较少,表明其可能参与卵巢的分化过程。
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1 高长富;红鳍东方鲀amhrⅡ和amh基因的表达研究及性腺转录组的初步研究[D];大连海洋大学;2016年
2 袁桢;特发性卵巢早衰与AMH,AMHR-Ⅱ基因多态性的相关性研究[D];南方医科大学;2014年
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