收藏本站
《中国医科大学》 2008年 博士论文
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

牙龈卟啉单胞菌侵入血管内皮细胞后粘附分子表达及信号调控的研究

张冬梅  
【摘要】:牙周炎是一种由菌斑细菌引发的慢性感染性疾病,是人类口腔两大疾病之一,发病率较高。大量的研究显示慢性牙周炎已成为心血管疾病的独立危险因素,使动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)和冠心病等心血管疾病的患病风险大大增加。以往的理论认为AS主要是局部脂质堆积性疾病,近年来,AS发病机制的炎症观点又重新被强调。目前研究认为AS是一个进行性的炎症反应,局部和远隔部位感染可以促进AS的慢性炎症过程。由于AS病因复杂,既包括与脂蛋白代谢有关的基因,也包括环境因素的影响,且病变发生较慢,在早期无症状,故对其病因和发病机制的研究进展仍然较慢。而大多数的牙周疾病是可以预防和控制的,有效的牙周治疗、积极的控制口腔感染为我们提供了一条减少心血管疾病发生危险的可能途径。 牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)是目前公认的慢性牙周炎重要可疑致病菌,它的多种毒性因子可引发宿主的免疫炎症反应,导致牙龈组织破坏和局部血管改变,使菌血症发生的可能性和严重性大大增加。Haraszthy和Kozarov等用PCR的方法证实AS斑块内P. gingivalis的存在;Lalla和Gibson等的动物实验研究显示P. gingivalis通过口腔感染载脂蛋白E缺陷小鼠可增加早期AS和血管炎症的发生。还有研究表明P. gingivalis能够进入血液循环系统,进而粘附、侵入血管内皮细胞,并在细胞内增殖,这使P. gingivalis感染与AS疾病的联系更加密切。同其他血管壁细胞一样,血管内皮细胞可能作为P. gingivalis菌体或菌体成分的储存库,在P. gingivalis感染机体的过程中刺激机体产生免疫炎症反应。 在AS疾病发生过程中,血管内皮细胞是单核细胞粘附聚集的关键部位,细胞-细胞、细胞-基质间相互粘附、相互作用几乎贯穿了AS的整个病理过程,因此了解引起细胞间相互作用的因素及机理,采取相应的措施,对防治血管病发生、发展有着重要意义。细胞间粘附的分子基础是粘附分子表达,在体内正常细胞不表达或仅轻微表达粘附分子,在AS斑块部位发现内皮细胞活化,大量表达细胞粘附分子,包括细胞间粘附分子1(intercellular adhesion molecule 1, ICAM-1)、血管细胞粘附分子1(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)和E选择素等,其作用主要是通过识别并结合对方细胞膜上的特异性配体而完成细胞间的粘附。内皮细胞分泌的粘附分子对AS病变的形成和发展有重要作用。 我们推测P. gingivalis侵入血管内皮细胞可导致粘附分子高表达的AS样改变。本研究建立P. gingivalis侵入血管内皮细胞模型,模拟P. gingivalis感染血管壁细胞的体内环境,观察P. gingivalis侵入后粘附分子ICAM-1、VCAM-1和E选择素表达的变化,探讨P. gingivalis在AS疾病发生中的可能作用,并进一步完成调控细胞粘附分子表达的信号通路的初探。 材料与方法 一、实验材料 P. gingivalis低毒力株ATCC 33277(由首都医科大学口腔医学院科研所提供)和高毒力株W83(由美国佛罗里达大学牙科学院口腔生物研究所Dr. Lamont RJ教授惠赠),人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vain endothelial cell, HUVEC)株ECV304(购自南京凯基生物科技开发有限公司),甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT) (Sigma), Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒(深圳晶美生物技术有限公司),碘化丙啶(propidium iodide, PI) (Sigma),DNA抽提试剂盒(Qiagen),RNA提取试剂Trizol Reagent (Invitrogen), RT-PCR试剂盒(TaKaRa),鼠抗人ICAM-1单克隆抗体(Santa Cruz),兔抗人VCAM-1、E选择素多克隆抗体(Santa Cruz),兔β-肌动蛋白(actin)多克隆抗体(北京博奥森生物技术有限公司),鼠抗人IκB-α、磷酸化p38MAPK、NF-κB p65单克隆抗体(Santa Cruz),碱性磷酸酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG(北京博奥森生物技术有限公司),异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate, FITC)标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG(北京博奥森生物技术有限公司),MG132 (CALIOCHEM), SB203580 (Promega) 二、实验方法 1、选择P. gingivalis低毒力株ATCC 33277和高毒力株W83、人脐静脉血管内皮细胞株,建立P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入HUVEC模型。 2、MTT比色法检测P. gingivalis侵入前后细胞增殖活性变化,流式细胞仪测定细胞周期。 3、Annexin V-FITC凋亡试剂盒检测细胞凋亡率,免疫荧光染色和细胞核DNA阶梯状图谱电泳分析进一步证实细胞凋亡 4、RT-PCR和Western印迹法检测P. gingivalis侵入血管内皮细胞前后ICAM-1、VCAM-1和E选择素基因的mRNA及蛋白表达变化,细胞免疫荧光染色法测定ICAM-1、VCAM-1和E选择素膜蛋白表达。 5、Western印迹法检测IκB-α和磷酸化p38 MAPK表达;间接免疫荧光法检测HUVEC NF-κB p65核移位。 6、NF-κB抑制剂MG132和p38 MAPK抑制剂SB203580预处理细胞后,分别建立P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入模型,分析NF-κB/IκB和p38 MAPK信号通路在P. gingivalis侵入血管内皮细胞影响粘附分子表达过程中的作用。 三、统计分析 结果以均数±标准差(x±s)表示,实验重复3次,采用SAS 8.12软件包,多组均数之间的比较采用重复测量资料的方差分析,P0.05为差异有统计学意义。 实验结果 1、牙龈卟啉单胞菌侵入对血管内皮细胞增殖和凋亡的影响 P. gingivalis侵入后48h,未见细胞增殖受抑制。与对照组比较,P. gingivalis ATCC 33277侵入后72h,细胞增殖活性降低12.46%;W83侵入后72h,细胞增殖活性降低10.47%,细胞生长增殖活性明显受抑制(P0.05)。P. gingivalis ATCC 33277和W83的增殖抑制作用无显著性差异(P0.05);P. gingivalis侵入改变细胞周期分布,使G1期细胞增加(P0.05),细胞周期在G1期发生阻滞,P. gingivalis W83使细胞周期发生改变的时间(24h)早于ATCC 33277 (48h); P. gingivalis侵入后24h即诱导凋亡细胞的产生(P0.05)。P. gingivalis W83侵入后72h,死亡细胞明显增加(16.407%),与ATCC 33277侵入组(11.973%)比较有显著差异(P0.05)。荧光显微镜观察证实凋亡细胞的存在;阶梯状电泳图谱分析显示P.gingivalis W83作用后24h和48h,HUVEC的核DNA呈现明显的拖尾条带,形成典型的DNA ladder. 2、牙龈卟啉单胞菌侵入对血管内皮细胞粘附分子表达的的影响P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入后4h即诱导ICAM-1、VCAM-1和E选择素mRNA表达(P0.05)。ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达水平在P. gingivalis侵入后8h达高峰(P0.05),这种高表达可持续到P. gingivalis侵入后24h(P0.05)。E选择素mRNA表达在P. gingivalis侵入后4h达高峰(P0.05),8h显著回落(P0.05),至24h时接近基础表达水平(P0.05);P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入后4h即诱导ICAM-1、VCAM-1和E选择素膜蛋白表达(P0.05),ICAM-1和VCAM-1蛋白表达在侵入后8h和24h有持续的高表达(P0.05);E选择素蛋白表达在侵入后8h达高峰,侵入后24h仍有较高的表达(P0.05);P. gingivalis W83诱导ICAM-1、VCAM-1和E选择素nRNA和蛋白表达的能力强于ATCC 33277(P0.05).细胞免疫荧光染色证实P. gingivalis W83侵入血管内皮细胞后8h诱导ICAM-1、VCAM-1和E选择素膜蛋白的表达。 3、牙龈卟啉单胞菌感染血管内皮细胞诱导IκB降解、p38 MAPK磷酸化和NF-κB p65核移位 P. gingivalis ATCC 33277感染HUVEC后60min导致IκB-α降解,感染后90minIκB-α恢复至基础水平;P. gingivalis W83感染后30min后即导致IκB-α降解,60min后IκB-α蛋白水平有轻度回升,90min后IκB-α恢复至基础水平;P. gingivalis W83感染使细胞IKB-a降解时间早于ATCC 33277. P. gingivalis ATCC 33277作用于细胞后30min后导致p38 MAPK磷酸化,60min后p38 MAPK磷酸化水平明显降低,90min后恢复至基础水平;P. gingivalis W83感染HUVEC后60min导致p38 MAPK磷酸化,90min后p38 MAPK磷酸化水平明显降低。P. gingivalis ATCC 33277感染HUVEC后60min开始激活NF-κB p65核移位,感染后90min,核移位现象更明显;W83感染HUVEC后30min即开始有NF-κB p65核移位,核移位一直持续到W83感染后90min。 4、NF-κB和]p38 MAPK信号通路抑制剂在P. gingivalis感染HUVEC诱导IκB-α降解、p38 MAPK磷酸化、NF-κB p65核移位和粘附分子表达过程中的作用 NF-κB抑制剂MG132(20μM)和P38 MAPK抑制剂SB203580(10μM)预处理细胞30min后,再分别与P. gingivalis ATCC 33277和W83(MOI=100:1)共同培养60min、90min和8h。Western印迹法检测IκB-α和磷酸化p38 MAPK蛋白表达变化,细胞免疫荧光染色检测NF-κB P65核移位。结果显示MG132可抑制P. gingivalis W83感染HUVEC诱导的IκB-α降解、NF-κB p65核移位和ICAM-1、VCAM-1、E-selectin mRNA和蛋白表达,对p38 MAPK磷酸化无影响;SB203580可抑制P. gingivalis W83感染导致的p38 MAPK磷酸化,对IκB-α降解、NF-κB p65核移位和ICAM-1、VCAM-1、E-selectin mRNA和蛋白表达无影响。 结论 1、P. gingivalis侵入血管内皮细胞可抑制其增殖,使细胞周期在G1期细胞发生阻滞,并诱导细胞凋亡及ICAM-1、VCAM-1、E选择素mRNA和蛋白高表达的AS样改变,在AS炎症病理反应中有重要的意义。有效的牙周治疗、积极的控制口腔感染为我们提供了一条减少心血管疾病发生危险的可能途径。 2、P. gingivalis ATCC 33277和W83侵入血管内皮细胞诱导IκB降解、p38 MAPK磷酸化和NF-κB核移位。NF-κB系统的活化参与了P. gingivalis侵入HUVEC诱导粘附分子表达的过程,NF-κB系统在P. gingivalis感染后的全身炎症反应中发挥重要的调控作用,对其进行有效的阻断和调节,将可能控制P. gingivalis感染导致血管内皮细胞粘附分子高表达的AS样改变。 3、与低毒力株P. gingivalis ATCC 33277比较,高毒力株P. gingivalis W83显示更强的细胞毒性,侵入后72h导致更多的细胞死亡P. gingivalis W83诱导血管内皮细胞ICAM-1、VCAM-1和E-selectin表达的能力强于P. gingivalis ATCC 33277,这可能与其侵袭性或致脓肿作用有关。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 金笑一!100050,杨圣辉!100050,王申五!100044,刘红!100044,张春梅!100050,潘秀英!100044;多聚酶链反应检测牙周病人及其家庭成员中的牙龈卟啉单胞菌[J];北京口腔医学;1997年04期
2 汤亚玲,谭红,叶玲,肖晓蓉,黄定明;黄芩对牙龈卟啉单胞菌生长、形态影响的体外实验[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2002年12期
3 刘洁;牙周病与心血管疾病的相关性及其可能机制[J];北京口腔医学;2004年02期
4 张迪亚,陈莉丽;牙龈卟啉单胞菌脂多糖引起牙周炎症的机制和特点[J];国外医学.口腔医学分册;2005年06期
5 毛松,陈森,何安光;牙龈卟啉单胞菌对脐静脉血管内皮细胞表达IL-8和MCP-1 mRNA的影响[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2002年02期
6 刘静波;潘亚萍;;牙龈卟啉单胞菌致病岛研究进展[J];国际口腔医学杂志;2009年02期
7 贾晓真,樊明文,边专,陈智,李成章;牙龈卟啉菌及其胶原酶基因遗传多样性的研究[J];中华口腔医学杂志;2002年05期
8 吴燕岷,陈莉丽,严杰,唐琪,孙伟莲;应用PCR检测慢性牙周炎患者龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌及感染菌株基因型的分析[J];中华微生物学和免疫学杂志;2002年01期
9 毛松,前野伸昭,小田宏;多粘菌素B和热处理对牙龈卟啉单胞菌诱导ECHUV产生sICAM-1的影响[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2002年01期
10 刘锐,董小平,杨圣辉,周伟,郑颖;牙龈卟啉单胞菌prtH基因分布与多态性研究[J];中华微生物学和免疫学杂志;2004年04期
11 张凤秋,杨连甲,吴织芬,秦鸿雁;牙龈卟啉单胞菌基因真核表达载体构建及其在哺乳动物细胞中的表达[J];华西口腔医学杂志;2004年06期
12 张结;高津福;;牙龈卟啉单胞菌与冠心病[J];牙体牙髓牙周病学杂志;2007年12期
13 寇育荣;潘亚萍;;牙龈卟啉单胞菌膜泡对牙龈上皮细胞MMPs基因表达的影响[J];临床口腔医学杂志;2008年03期
14 石卓瑾;陈莉丽;;牙龈卟啉单胞菌牙龈素在牙周炎症过程中的作用及其机制[J];国际口腔医学杂志;2008年S1期
15 邓辉;吴亚菲;;牙龈卟啉单胞菌与动脉粥样硬化发病的关系[J];国际口腔医学杂志;2009年04期
16 胡少鹏;刘福祥;杨红;李灵;潘兰兰;马媛媛;;美洲大蠊提取物体外抑制牙龈卟啉单胞菌的生长[J];国际口腔医学杂志;2009年05期
17 代雪茹;马晟利;吕秋菊;孙剑;;血链球菌对牙周炎主要致病菌拮抗作用机理研究[J];中国实验诊断学;2010年01期
18 唐保柱;任晓斌;陈玉华;和红兵;;牙龈卟啉单胞菌诱导骨细胞凋亡的实验研究[J];中国实用口腔科杂志;2010年10期
19 张菲菲;夏庆银;胡少鹏;苗玉华;;甘草酸对牙龈卟啉单胞菌生长影响的体外研究[J];广东牙病防治;2011年03期
20 王志凌,肖晓蓉,周学东,彭雪梅,廖运茂;对氨基苯甲酸对牙龈卟啉单胞菌细胞形态影响的扫描电镜观察[J];华西口腔医学杂志;2003年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 苏征;方厂云;;牙龈卟啉单胞菌脂多糖对牙周膜成纤维细胞胶原吞噬作用的影响[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
2 孙瑜;余杰;唐琳;;慢性根尖周炎患者牙龈卟啉单胞菌基因检测[A];全国第三次牙体牙髓病学临床技术研讨会论文汇编[C];2009年
3 刘斌;程岚;刘大力;汪嘉;张秀丽;束蓉;梁景平;;p38 MAPK信号通路在牙龈卟啉单胞菌脂多糖诱导人主动脉内皮细胞表达VCAM-1中作用的研究[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
4 刘利霞;朱昀;李茵;郑东翔;;人工合成抗菌肽对牙龈卟啉单胞菌的体外抑菌作用的初步研究[A];第六次全国口腔修复学学术会议论文摘要汇编[C];2009年
5 卢煜;罗世高;黄定明;周学东;;牙髓成纤维细胞胞内感染牙龈卟啉单胞菌模型的建立[A];2007年第七次全国牙体牙髓病学学术会议论文集[C];2007年
6 孙卫斌;季勇;;牙龈卟啉单胞菌对人血管内皮细胞一氧化氮的影响[A];中华口腔医学会老年口腔医学专业委员会换届选举暨第四届全国老年口腔医学学术研讨会论文汇编[C];2008年
7 刘锐;侯本祥;;逆行性牙髓炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌rgpA基因的PCR-RFLP分析[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
8 李涢;刘颖;杨圣辉;;洗必泰W/O/W型复乳剂缓释作用的初步研究[A];全国第三次牙体牙髓病学临床技术研讨会论文汇编[C];2009年
9 谭洁;冯雪;王凤前;李宝龙;单毓娟;;p38 MAPK在莱菔硫烷诱导Ⅱ相代谢酶和下调环氧化酶表达中的作用[A];中国毒理学会第三届中青年学者科技论坛暨2011年全国前列腺药理毒理学研讨会论文集[C];2011年
10 秦伟;林正梅;凌均棨;;P38 MAPK在BMP-2诱导牙髓细胞向成牙本质细胞样细胞分化中的作用[A];全国第八次牙体牙髓病学学术会议论文汇编[C];2011年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张冬梅;牙龈卟啉单胞菌侵入血管内皮细胞后粘附分子表达及信号调控的研究[D];中国医科大学;2008年
2 雷浪;高脂血症影响载脂蛋白E基因敲除小鼠对牙龈卟啉单胞菌的先天免疫并促进牙周病进展的研究[D];福建医科大学;2012年
3 范震;Ni~(2+)对龈下微生物影响的体外研究[D];四川大学;2004年
4 毛松;牙龈卟啉单胞菌诱发牙周炎病理机制的研究[D];中国医科大学;2002年
5 林莉;牙龈卟啉单胞菌高毒力株W83致病基因筛选[D];中国医科大学;2006年
6 陈旭;青春期龈炎龈下菌斑中牙龈卟啉单胞菌的牙龈蛋白酶K及其基因型的研究[D];中国医科大学;2006年
7 王舰;牙龈卟啉单胞菌对牙龈上皮细胞基质金属蛋白酶表达影响的研究[D];中国医科大学;2009年
8 滕笛;口腔细菌影响绿脓假单胞菌感染肺上皮细胞的体外研究[D];中国医科大学;2009年
9 李红旭;乳过氧化物酶抗菌系统对牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌的抑制作用及机制研究[D];四川大学;2005年
10 高宁;口腔修复材料—镍铬铍合金中铍对龈下微生物影响的研究[D];四川大学;2005年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 林玉祥;牙龈卟啉单胞菌脂多糖对血管内皮细胞功能影响的实验研究[D];遵义医学院;2010年
2 郑重阳;血链球菌和/或牙龈卟啉单胞菌对血小板聚集作用的研究[D];浙江大学;2011年
3 顾飞;牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白诱导内皮细胞炎症反应的信号通路研究[D];遵义医学院;2011年
4 肖莉;ⅣfimA型牙龈卟啉单胞菌重组菌毛对血管内皮细胞功能的影响[D];遵义医学院;2010年
5 马传传;种植修复患者龈沟液内牙龈卟啉单胞菌和血链球菌的观察研究[D];安徽医科大学;2012年
6 崔红花;牙龈卟啉单胞菌牙龈素促凝血功能域HGP44的基因克隆重组和表达[D];浙江大学;2010年
7 姚望;乳铁蛋白对牙龈卟啉单胞菌胰酶样蛋白酶活性的影响[D];吉林大学;2011年
8 崔平平;牙龈卟啉单胞菌上清液对人脐静脉内皮细胞分泌炎性因子的影响[D];昆明医学院;2011年
9 孙晓瑜;抗牙龈卟啉单胞菌卵黄抗体对大鼠实验性牙周炎的治疗作用[D];安徽医科大学;2011年
10 陈玉华;云南白药对牙龈卟啉单胞菌诱导骨破坏的干预研究[D];昆明医学院;2011年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978