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《中国医科大学》 2018年
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天麻素通过Nrf2信号通路逆转大鼠糖皮质激素性骨质疏松分子机制研究

刘盛业  
【摘要】:目的:糖皮质激素是广谱有效的抗炎及免疫抑制剂。而长期或高剂量使用糖皮质激素会造成糖皮质激素性骨质疏松,其属于继发性骨质疏松,被认为是最常见的医源性引发的一组代谢性骨病。在其发生机制中,单位体积内骨组织量明显减少主要由于新生骨量减少和骨质吸收增多所致,伴随其发生的将是骨质量下降、骨质疏松性骨折的发生。尽管临床实践中人们对糖皮质激素引起的骨质疏松的防范意识有所增加,但是对其所带来的副作用及灾难性的损害还有所欠缺,对致病机制以及防治方法的了解还有所不足。因此,有必要研发新的药物品种用于预防和治疗。近年来,天然药物成分在人们心中具有极高的认同度,在众多提取物中,天麻素特有的药用价值长久以来一直受到人们的青睐。如何发掘出天麻素的潜质,探索其能否靶向逆转糖皮质激素性骨质疏松,为本课题研究的重点所在。综上,本研究拟探讨天麻素与地塞米松相互作用对成骨细胞细胞生物学行为变化的影响。同时深入挖掘其中可能的调控机制,判断Nrf2信号通路相关分子在此过程中的变化。并在此基础上,通过构建糖皮质激素性骨质疏松大鼠模型,验证天麻素对骨组织微结构及其生物力学特性的影响。研究方法:1、选取MC3T3-E1成骨细胞系与提取的新生鼠头盖骨原代成骨细胞为研究对象,利用CCK-8法,碱性磷酸酶活性测定法、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡测试及Hoechst33258染色等方法检测天麻素对DEX诱导成骨细胞生物学行为方面的影响。2、运用RNA干扰技术,mitoSOX?Red、DCFH-DA荧光探针及JC-1线粒体膜电位检测,明确Nrf2通路在其中的具体作用机制。3、茜素红染色观察天麻素对DEX诱导细胞成骨分化的功能性的保护作用。4、实时荧光定量PCR以及免疫蛋白印迹蛋白分析检测分化、凋亡、线粒体及内质网应激相关转录因子和蛋白的表达水平。5、显微电子计算机断层扫描技术扫描大鼠模型股骨骨小梁三维细微结构。6、双能X线吸收测定法检测骨密度变化。7、制作脱钙骨切片HE染色观察骨组织形态学变化。8、三点应力实验进行骨骼机械性测试明确其力学特性。结果:1、成功从新生鼠头盖骨提取原代成骨细胞进行原代细胞培养,同时结合MC3T3-E1成骨细胞系共同用于后续实验。2、CCK-8法及碱性磷酸酶活性测定法检测结果显示:与高剂量地塞米松单独处理组对比,天麻素预处理成骨细胞可减轻地塞米松对细胞增殖活性的抑制作用,同时提升碱性磷酸酶活性。3、Annexin VFITC/PI细胞凋亡测试及Hoechst33258染色结果显示:高剂量地塞米松诱导成骨细胞凋亡,预处理天麻素能够有效拮抗凋亡作用,提升细胞生长活性。4、茜素红染色观察结果显示:地塞米松诱导抑制细胞成骨分化钙结节形成,加入天麻素共同培养组有效改善钙结节形成,促进成骨分化。5、运用RNA干扰技术,观察转染效率,结果提示:细胞转染成功,si-Nrf2转染组Nrf2表达显著下降。同时利用mitoSOX?Red及JC-1线粒体膜电位测试,结果显示:高剂量地塞米松单独处理显著提升细胞线粒体活性氧表达水平并造成线粒体膜电位损伤,预处理天麻素可以减小线粒体应激水平,维持线粒体膜电位稳态,而沉默Nrf2会削弱天麻素发挥的保护作用。ATP活性测试和DCFH-DA荧光探针检测结果显示:天麻素逆转地塞米松,降低细胞整体活性氧表达水平,显著改善ATP生成。以上结果共同提示天麻素通过调节Nrf2信号通路保护细胞线粒体功能。6、实时荧光定量PCR检测结果显示:MC3T3-E1实验中,地塞米松抑制成骨分化指标Runx2、Osterix、BMP-2、OCN表达水平,预处理天麻素缓解抑制作用,提升分化水平。相同条件下,免疫蛋白印迹蛋白分析检测结果显示:Runx2、OCN表达上调,成脂肪分化PPARγiso2水平下降,并且Nrf2、HO-1、NQO-1表达水平上调。原代成骨细胞实验中,相同的细胞分组条件下,内质网应激指标GRP78、phospho-e IF2α、CHOP下降,线粒体凋亡指标AIF、cleaved caspase3、bax、cytochrome C表达水平下调,抗凋亡指标bcl-2表达上调。并且天麻素在地塞米松条件下通过Nrf2关键蛋白调控下游HO-1、NQO-1表达水平。7、制作脱钙骨切片HE染色观察骨小梁结构结果显示地塞米松诱导骨质疏松大鼠模型造模成功,模型组骨小梁密度减小,宽度减小。药物治疗组有所改善,并在浓度呈现浓度依赖性。8、双能X线吸收测定法检测骨密度测试结果显示:天麻素通过逆转地塞米松增加股骨骨密度改善骨质量。9、显微电子计算机断层扫描技术扫描大鼠模型股骨骨小梁三维细微结构显示:天麻素拮抗地塞米松诱导,保护股骨近端骨小梁三维结构,增加小梁密度。与地塞米松模型组相比,相对骨体积或骨体积分数(BV/TV)、连接密度(Conn.D)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)增大、骨小梁分离度(Tb.Sp)、结构模型指数(SMI)下降,以上骨微结构参数有所改善。10、三点应力实验进行骨骼机械性测试结果显示:天麻素可在地塞米松诱导条件下增大股骨的最大抗弯载荷与其刚度。结论:天麻素能显著降低地塞米松对成骨细胞增殖活性及碱性磷酸酶活性的抑制作用,同时通过激活Nrf2及下游关键信号分子HO-1和NQO-1,减轻地塞米松诱导的线粒体靶向和细胞整体氧化应激水平升高,维持线粒体和内质网稳态,减少应激,防止成骨细胞凋亡。同时,天麻素可以逆转地塞米松条件下钙结节形成,提高成骨分化水平。糖皮质激素性骨质疏松大鼠模型验证得出天麻素可以改善地塞米松造成的大鼠股骨骨小梁微结构的破坏,使骨小梁密度升高、结构加强,并改善骨微结构参数,提升骨密度,同时增加骨强度,增强骨组织机械力学特性。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R285.5

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【参考文献】
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