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《中国医科大学》 2018年
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NF-κB乙酰化介导低氧条件下DDAH1基因的表达调控

陈凯师  
【摘要】:前言:心脑血管疾病(Cardio-cerebrovascular disease,CCVD)是一类由遗传和环境共同作用导致的多因素疾病,已成为全球较常见的死因。血管的病理学改变如血管壁血脂的沉积、慢性的炎症反应和血管平滑肌的增生等,会导致局部组织的缺血缺氧。有研究发现缺氧可以导致舒血管因子一氧化氮(NO)产生量的增加。NO是调节血管舒缩功能的主要调节剂,在血管内环境稳定中起关键作用,它由一氧化氮合酶(NOS)酶产生。非对称性二甲基精氨酸(Asymmetric dimethylarginine,ADMA)是一种内源性NOS抑制剂,是心血管死亡率和慢性肾脏疾病进展的危险因素。循环中的ADMA主要由二甲基精氨酸二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase,DDAH)降解。DDAH有两种亚型,包括DDAH1和DDAH2,研究显示DDAH1是降解ADMA的关键酶,并有研究表明DDAH1启动子区存在着几个脂类代谢和炎症相关的转录因子作用位点。NF-κB是一种参与介导细胞炎症反应的核转录因子,缺氧会在不同程度上引起细胞组织的炎症反应,同时低氧条件下NF-κB与靶DNA结合并引发了一系列促炎的基因的转录。NF-κB乙酰化增强其与DNA之间的结合,促进基因的转录,本课题组前期已经证实NF-κB通过乙酰化参与nNOS和DDAH2基因的表达调控。本研究中,通过JASPAR等生物信息学软件预测NF-κB在DDAH1启动子区结合位点,用CoCl_2模拟低氧条件,拟通过相关分子生物学技术检测细胞中DDAH1的表达水平及转录因子结合情况;同时,用TSA刺激SH-SY-5Y和HEK293细胞促进相关蛋白发生乙酰化,鉴定NF-κB在低氧条件下对DDAH1的调节机制。阐明一种心脑血管疾病发生的可能分子机制,并可能为心脑血管疾病的治疗提供一种新的治疗策略。材料与方法:一、实验材料1、人胚肾细胞系HEK2932、人神经母细胞瘤细胞系SH-SY-5Y3、Real-time PCR及Western印迹杂交相关试剂4、免疫沉淀相关试剂5、荧光素酶载体构建及检测相关试剂6、ChIP和DNA结合实验相关试剂二、实验方法1、分别用Co Cl_2(模拟低氧)、TSA(抑制去乙酰化酶)及低氧和乙酰化联合作用处理HEK293、SH-SY-5Y细胞系,应用Real-time PCR及Western印迹杂交检测不同时间点的DDAH1表达水平;2、构建荧光素酶表达载体,分别检测正常情况下启动子活性及低氧、乙酰化、低氧和乙酰化联合作用对启动子活性的影响;3、应用ChIP及DNA结合实验分别验证NF-κB与DDAH1启动子区体内和体外结合情况;4、应用IP及Western印迹杂交实验,检测低氧、乙酰化及低氧和乙酰化联合作用下SH-SY-5Y细胞系中NF-κB的乙酰化水平。实验结果:1、在HEK293、SH-SY-5Y细胞系中,用CoCl_2(100μM)模拟低氧条件,应用Real-time PCR及Western印迹杂交实验,检测正常细胞及低氧处理后6h、12h和24h DDAH1的表达水平,结果显示低氧能上调DDAH1的mRNA和蛋白表达水平。2、JASPAR和ALIBABA2等软件预测结果显示:在DDAH1的启动子区存在NF-κB结合位点,位于DDAH1启动子区翻译起始位点上游-1237~-1228位置,提示DDAH1可能是NF-κB潜在靶基因。3、双荧光素酶报告基因实验结果显示:与p GL-3及pGL-1194组相比,p GL-1291组荧光素酶活性升高(P0.05);低氧、乙酰化及二者联合处理细胞后,p GL-1291组荧光素酶活性均显著上升(P0.05)。4、ChIP实验中,用NF-κB抗体进行染色质免疫沉淀,然后用PCR扩增DNA沉淀,琼脂糖凝胶电泳结果显示存在138bp大小的DNA条带,证明在体内NF-κB能够与DDAH1启动子区的NF-κB反应元件结合。5、DNA结合实验中,未经生物素标记的DNA探针组没有条带;然而经生物素标记的DNA探针组,出现与input组大小一致的蛋白条带,证明在体外NF-κB能够与DDAH1启动子区的NF-κB反应元件结合。6、IP结合Western Blot检测低氧、乙酰化及低氧和乙酰化联合作用下NF-κB的乙酰化水平,结果显示NF-κB的乙酰化水平均上升(P0.01)。7、在HEK293、SH-SY-5Y细胞系中,用TSA(250ng/mL)处理细胞,作为乙酰化因素,应用Real-time PCR及Western Blot检测正常细胞及TSA处理后6h、12h和24h DDAH1的表达水平,结果显示,乙酰化能上调DDAH1的mRNA和蛋白表达水平。8、在HEK293、SH-SY-5Y细胞系中,用CoCl_2(100μM)和TSA(250ng/mL)联合处理细胞,Real-time PCR及Western Blot检测结果显示,低氧与乙酰化联合处理能上调DDAH1的mRNA和蛋白表达水平。结论:1、DDAH1是NF-κB的靶基因之一;2、NF-κB通过乙酰化的方式参与低氧条件下DDAH1基因的表达调控。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R394

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