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《中国医科大学》 2018年
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ANKHD1通过调控YAP1及其磷酸化促进非小细胞肺癌细胞增殖

刘晓芳  
【摘要】:锚蛋白重复序列ANK是蛋白数据库中最常见的蛋白序列之一,在酵母和果蝇中首次确定的,具有33个氨基酸的序列重复12-24次。具有多个锚蛋白重复序列和一个单独的KH结构域的MASK蛋白是通过基因筛选的方法在果蝇中首次被发现的。MASK在人类中的的直系同源蛋白是ANKHD1(包含锚蛋白重复序列和一个KH结构域),过去曾经被命名为hMASK,于2003年是由Poulin等在前列腺癌细胞系LNCaP中发现的。ANKHD1蛋白的编码基因位于人类5号染色体长臂3区。所含有的锚蛋白重复序列表明了ANKHD1作为骨架蛋白的作用,主要可以介导蛋白之间的相互作用,是细胞周期控制、转录调节、分化、凋亡和细胞骨架组织等生物学过程的基础。KH结构域主要可以介导蛋白质与核酸之间的相互作用。ANKHD1(锚蛋白重复和KH结构域包含蛋白1),是一种在正常人类组织中普遍表达的蛋白,并且在某些癌症组织中高表达。ANKHD1主要位于细胞浆,也有研究发现其在细胞核中也有表达。有研究发现,在正常造血细胞和急性白血病细胞中定位于胞浆,细胞核中未见表达;在多发骨髓瘤的细胞系中胞浆和胞核中均有表达。因为其对P21有直接的调节作用,研究者猜测其存在着胞浆和胞核的转运而发挥作用,ANKHD1可以通过影响细胞周期相关蛋白而调节细胞周期,影响肿瘤细胞的增殖。十余年来,逐渐有学者研究ANKHD1在疾病中的作用,包括在多发骨髓瘤、急性白血病和前列腺癌等细胞系的研究。另有研究发现ANKHD1在果蝇和人类的Hippo通路中YAP1的激活起到了非常重要的作用。在果蝇的S2细胞系的体外研究中,研究人员发现沉默MASK的表达能够特异性的减低Yki的活性,并且在果蝇中组织的正常生长和Yki靶基因的表达是必要的。在体研究发现,蛋白Mask可以和蛋白Yki形成复合物的形式而发挥作用。应用探针的办法在乳腺癌病人的基因表达数据文件中检测MASK1mRNA的第一个锚蛋白重复序列,发现MASK1的表达水平较低的病人预后越好。后来又有学者在前列腺癌细胞系的研究中证明ANKHD1通过与YAP1结合,激活YAP1,通过调节CyclinA的表达从而影响肿瘤细胞生长和细胞周期的进展,沉默ANKHD1可以使得YAP1在mRNA和蛋白水平均下调。YAP1是Hippo信号通路的核效应因子,编码基因位在染色体11q13,其编码Yes相关蛋白YAP,YAP为65kda的蛋白,由1至2个WW结构域、羧基末端的PDZ结合序列、氨基末端富脯氨酸结构域、14-3-3蛋白结合位点及SH3结合基序构成。Hippo信号通路可被各种不同的上游信号激活,包括G蛋白偶联受体,细胞接触、细胞外基质、细胞极性及细胞粘附分子或连接蛋白等。在人类中,重要的Hippo信号通路的分子有Yes-associated protein1(YAP1),Large tumor suppressors 1 and2(LATS1/2),MammalianSTE-20 kinases1and2(MST1/2)和Msp-one-binder(MOB1),这些分子是进化保守的,并且在肿瘤的发生中起到抑制因子的作用。Hippo通路激活后,能够依次磷酸化激酶MST1/2,LATS1/2,而后者可磷酸化YAP1,YAP1丝氨酸磷酸化导致了细胞浆的隔离和降解。失活后,非磷酸化状态的YAP1激活,进入细胞核。然后,YAP1发挥转录激活因子的作用,能够与各种不同的转录因子结合如:ErbB4,p53,BP-2,RUNX2,TEAD1-4和p73,进而调节多种基因的表达、调控它们的转录活性,但其自身并没有转录活性。目前的研究表明,ANKHD1在细胞功能相关的信号通路中可能有很多作用,如转录调节、细胞周期调控和细胞生存。至今,尚未有ANKHD1在非小细胞肺癌中的表达对预后的影响相关研究,本研究的目的旨在探索ANKHD1是否通过影响YAP的表达进而影响Hippo通路的活性而影响非小细胞肺癌的恶性表型的。材料与方法一、患者信息和样本本实验根据中国医科大学伦理委员会监督下进行。在中国医科大学附属第一医院搜集170例(1999年-2006年)非小细胞肺癌及30例对应的癌旁正常肺组织(距肿物边界大于5cm)标本,所有标本来源的患者均接受肺癌手术但没有接受过术前放化疗治疗,而且具有完整的随访资料,随访从手术之日起到随访结束日期或由于复发、转移而死亡之日止。其中男性为94例,女性为76例。根据WHO2015肺癌组织学分类标准和2010年国际抗癌联盟TNM分期标准进行重新评估。二、Cell linesHBE细胞系从ATCC(Manassas,VA,USA)细胞库获得。LK2购买于JCRB细胞库(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank),PG-LH7(LH7)、BE1是来自北京大学zheng jie教授的友好惠赠,A549、H1299、SPC-A-1(SPC)和LTEP-A-2(LTE)购于上海细胞库所有细胞系都用含10%的小牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)及100U/mL的青链霉素(Sigma,St.Louis,MO,USA)的RPMI 1640培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)并置于37°C,5%浓度的CO2细胞培养箱中培养。三、免疫组织化学将选取的病理标本的蜡块制备成4微米厚的切片。切片经二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水,抗原修复步骤后,染色采用S–P系统(KIT-9710,Ultrasensitive TM S-P,MaiXin,China),利用ANKHD1(1:100;Abcam,ab199164)抗体进行染色。空白对照组以PBS代替一抗。生物素标记的二抗(Ultrasensitive;MaiXin,Fuzhou,China)37℃孵育30分钟,DAB显色。在每张切片上,随机选5个视野,每个视野都进行计数约500个细胞。然后依据所计数的细胞着色的百分比,将表达ANKHD1的细胞数目进行划分,五个等级分别为:0分(无细胞着色),1分(1-25%的细胞着色),2分(26-50%的细胞着色),3分(51-75%的细胞着色),4分(76%以上的细胞着色)。依据细胞着色的强度,我们将ANKHD1的表达划分成4个等级:0分(无着色),1分(浅黄色颗粒),2分(黄色颗粒),3分(深黄色或者黄褐色颗粒)。每张切片的最终得分为:切片细胞数目等级评分与着色分数等级评分的乘积。将得分小于2判为阴性,而将得分大于或等于2以上判为阳性。四、Western Blot应用胰酶消化并收集培养瓶或培养皿中成指数生长的细胞后,加入裂解液(Pierce,Rockford,IL,USA)进行充分裂解,并利用超声使蛋白裂解更完全,冰上静置5分钟,放入提前4℃预冷处理的离心机离心10分钟,提取其总蛋白,然后用考马斯亮蓝进行浓度测定,并定量,加入6Xloading buffer,沸水煮样5分钟。上样,通过6%浓度的SDS-PAGE进行蛋白电泳,电泳结束后,将蛋白转印到PVDF膜上。将膜放入5%脱脂奶粉内室温摇床封闭1小时,加入ANKHD1(Abcam,ab1177881:500)LATS1(Cell Signaling Technology,#9153,1:1000);p-YAP(Cell Signaling Technology,#4911,1:1000);YAP(Cell Signaling Technology,#4912,1:1000);MST1(Cell Signaling Technology,#3682,1:1000/IB);CTGF(Santa Cruz Technology,sc-14940,1:100)GAPDH(Sigma#G8795;1:2000 IB);4℃过夜。分别加入山羊抗兔,或抗鼠的二抗(1:5000,Santa Cruz Biotechnology,Inc.CA,USA)后,37℃孵育1小时。TTBS洗膜后,ECL发光。五、质粒构建与转染干扰pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1质粒购自Origene公司(RC221886,Rockville,MD,USA)siRNA-ANKHD1(Santa Cruz Technology,sc-92073),shRNA-ANKHD1(Santa Cruz Technology,sc-92073-SH),将质粒按照相关说明用Lipofectamine 3000Transfection Reagent(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)转入细胞内,48h或72h后,利用Western blotting或实时定量PCR的方法检测相关蛋白和mRNA的表达。六、免疫荧光实验细胞经4%多聚甲醛固定,Triton X-100打孔,用5%BSA室温封闭1小时后,加入一抗ANKHD1(1:100;Abcam,ab199164),4℃孵育过夜,次日加入山羊抗兔/鼠二抗、罗丹明二抗避光孵育。细胞核采用DAPI染色,甘油封片,采用Radiance 2000荧光共聚焦显微镜(Carl Zeiss,Thornwood,NY,USA)采集图片。每一步染色之后均用PBS洗。七、MTT实验用胰酶消化转染或干扰24小时后的细胞,并制成单细胞悬液后吗,转入96孔板,每一个孔约移入3000个左右细胞,随后加入含10%的小牛血清的培养基培养24小时后,每孔加入20微升的5 mg/ml MTT(Thiazolyl Blue)溶液,保留只有培养液的对照孔。在37℃条件下,进行避光孵育,4小时后弃掉原溶液,加入150微升的DMSO溶解生成的MTT结晶,用分光光度计检测490nm波长的吸收峰值。本实验重复三次,并取平均值。八、基质胶侵袭实验采用一个24孔板,含有8μm微孔的Transwell小室(Corning,NY,USA),上室铺以双无的1640培养基按1:3的比例稀释的基质胶(BD Biosciences)。转染48小时后,100微升约含有5×10~5个细胞转移到不含血清的上室,孵育16小时,下室加入含有10%小牛血清的培养基,继续培养48小时,将表面细胞用棉签擦掉,将剩余细胞用预冷的4%甲醛固定,然后进行苏木素染色,1%盐酸酒精分化,返蓝10分钟。在显微镜下进行统计,具体方法为,随机选取10个视野计数侵袭到小室下的细胞数目。本实验重复三次,取平均值。九、集落形成实验将转染或干扰ANKHD1后的细胞,接种到6厘米细胞培养皿中(约1000个细胞/皿)孵育2周。用PBS洗涤后,吉姆萨染色、干燥,在显微镜下进行统计,计数超过50个细胞的克隆数。十、RNA提取和Real-time PCR使用RNeasy Plus Mini Kit(Qiagen,Hilden,Germany)从细胞中提取总RNA。根据PrimeScript~(TM) RT Master Mix(TaKaRa,China)实验说明书,1微克RNA用于逆转录实验。Real-time PCR采用使用总量为20微升体系的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)在7900实时定量PCR系统(Applied Biosystems,Foster City,CA)中完成。运行qRT-PCR反应板热循环反应为50℃2min,95℃10min,95℃40s,40个循环,然后60℃60s。GAPDH作为内参,基因表达的倍数改变采用2~(-ΔΔCt)方法计算,实验重复3次。实时定量PCR引物序列为:ANKHD1:5-AGACCAATCGGAACACGGCTCT-35-CAGAAGCTGCTTCCATCAAGGG-3YAP1:5-TGTCCCAGATGAACGTCACAGC-35-TGGTGGCTGTTTCACTGGAGCA-3GAPDH:5-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-35-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3十一、免疫共沉淀实验首先用预冷的PBS清洗细胞两遍,用NP-40裂解液冰浴5分钟后,将细胞裂解产物从培养皿中转移至新的EP管中,裂解产物在4℃条件下,16000g离心5分钟后,将上清转移至新管中,紫外分光光度计将蛋白定量,提取约200ug蛋白,加入足够量的抗体,4℃轻摇过夜,然后加入25 uL A/G蛋白磁珠(Beyotime,Jiangsu,China)4。C轻摇4h.然后将混合物1500×g 4。C离心5分钟,然后将上清去掉。将上一步骤所余沉淀物,用冰浴的RIPA缓冲液洗3次,加入样品缓冲液,在沸水中煮5min使免疫复合物与磁珠解离。然后收取免疫复合物进行Western blot检测。十二、动物实验20只BALB/c裸小鼠,4-6周龄,雌性,18-21g,从北京维通利华公司购买。于温度恒定,湿度恒定的半屏障系统中进行饲养,并且,裸鼠的饮用水和饲料都经过严格的灭菌处理。严格按照中国医科大学动物实验伦理条例,进行动物实验的实施。实验共分为4组(5只/组):分别为稳转空质粒的A549细胞组,稳转pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1的A549细胞组,稳转空质粒的SPC细胞组,稳转shANKHD1的SPC细胞组,调整各组细胞浓度至5×10~6个/ml,于裸鼠背部皮下注射0.2ml。从注射细胞的当天算起,进行连续观察,8周后统一处死,肿瘤称重后进行统计分析。十三、统计学分析将所有获得的数据采用SPSS软件19.0版本(SPSS,Chicago,IL,USA))进行统计学分析。Chi-Square检验ANKHD1表达与临床病理因素之间的关联。Kaplan-Meier法检测ANKHD1对患者生存时间的影响。其他结果的比较均采用t检验。p0.05则为有统计学意义。结果一、ANKHD1在非小细胞肺癌组织中表达上调1.在30例正常组织中,ANKHD1阳性表达为11例,阳性表达率为36.7%;阴性表达为19例,阴性表达率为63.3%。在170例非小细胞肺癌中,ANKHD1阳性表达为117例,阳性表达率为68.8%;阴性表达为53例,阴性表达率为31.2%.ANKHD1在肺癌中的表达明显上调(p=0.004)2.8对非小细胞肺癌组织和对应的癌旁正常组织进行Western Blot分析,检测ANKHD1蛋白表达情况。发现ANKHD1在肿瘤组织中的表达明显高于癌旁正常组织。二、ANKHD1的表达与非小细胞肺癌临床病理特征具有相关性ANKHD1的表达与患者年龄(p=0.615)性别(p=0.740)、组织学类型(p=0.743)、分化程度(p=0.188)和肿瘤大小(p=0.862)并无统计学关系;但是,ANKHD1的阳性表达与高的p-TNM分期(p=0.019)和淋巴结转移(p=0.020)有关。三、ANKHD1过表达与预后不良相关1.生存分析结果显示ANKHD1高表达的肺癌术后患者5年总体生存时间要低于ANKHD1阴性表达的患者(p=0.037),提示ANKHD1与患者预后相关;2.应用Cox线性回归分析肺癌患者危险因素,发现ANKHD1阳性表达和淋巴结转移是非小细胞肺癌患者的独立预后因素(p0.05,表3)。四、ANKHD1在非小细胞肺癌细胞系中发挥致癌因子作用在肺癌细胞系A549,SPC,H1299,LK2,LTE,BE1,LH7中,与正常人支气管上皮细胞系HBE相比,ANKHD1的mRNA和蛋白质水平呈高表达。在ANKHD1表达相对较低水平的细胞系A549中转染ANKHD1的质粒,在ANKHD1表达相对较高水平的细胞系SPC中干扰ANKHD1;并在48或72小时后检测转染和干扰效率。1.克隆形成实验结果表明,在A549细胞系中转染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1细胞克隆形成的数量显著升高。(转染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1与对照组相比:284±28 vs 140±20,p0.05))。在SPC细胞系中干扰ANKHD1的表达细胞克隆形成的数量显著降低。(对照组与ANKHD1siRNA组相比:186±41 vs 103±16,p0.05)。2.MTT实验:在A549细胞系中转染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1与对照组相比,增殖率增加;在SPC细胞系中干扰ANKHD1的表达,与对照组相比,增殖率降低。3.侵袭实验结果表明,侵袭实验结果表明,肺癌细胞系A549转染ANKHD1后侵袭细胞数相比于对照组明显增加(转染pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1组vs对照组:134±5 vs 43±6,p0.05);肺癌细胞系SPC干扰ANKHD1后侵袭细胞数相比于对照组明显减少(对照组vs ANKHD1siRNA组:160±10 vs 61±6,p0.05)五、ANKHD1表达上调能促进裸鼠移植瘤的形成裸鼠成瘤实验显示在A549中转染ANKHD1,相比于对照组,肿瘤的重量显著增加(shRNA-ANKHD1 vs对照组:0.798±0.068 vs 0.330±0.052,p0.05);在SPC中干扰ANKHD1与对照组相比,肿瘤的质量降低显著(对照组vs siRNA-ANKHD1:0.712±0.062 vs 0.290±0.067,p0.05)。六、ANKHD1能够影响Hippo下游靶基因CyclinD1和CTGF的表达转染和干扰ANKHD1后对HIPPO靶基因表达的影响在A549细胞系中转染ANKHD1后,CTGF及Cyclin D1的表达上调;在SPC细胞系中干扰ANKHD1,CTGF及Cyclin D1的表达下调。七、ANKHD1通过调控YAP1的表达影响Hippo通路的活性1.ANKHD1、YAP1在细胞浆和细胞核中均有定位,ANKHD1主要定位于胞浆,YAP1定位于细胞核。2.ANKHD1与YAP1结合,并促进YAP1mRNA及蛋白水平的上调。3.在H1299细胞系中分别转染空质粒、pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1、空质粒与siYAP、pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1与siYAP,分别行克隆形成实验和基质胶侵袭实验,结果表明:ANKHD1能够促进细胞增殖(empty vector vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1:84±4 vs 180±9,p0.001),(empty vector+siYAP vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1+siYAP:43±7 vs 56±5,p0.05)和侵袭(empty vector vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1:68±4 vs 134±6,p0.05),(empty vector+siYAP vs pCMV6-Myc/DDK-ANKHD1+siYAP:28±2 vs 34±2,p0.05),且这种作用是通过YAP实现的。结论1.ANKHD1在人类非小细胞肺癌中的表达上调,并与p-TNM分期、淋巴结转移及预后有显著的相关性2.ANKHD1能够促进非小细胞肺癌细胞增殖、侵袭。3.ANKHD1能够影响Hippo通路下游靶基因的表达。4.ANKHD1通过调控YAP1及其磷酸化影响Hippo通路的活性促进细胞增殖、侵袭。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R734.2

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