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《中国医科大学》 2018年
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LncRNA AFAP1-AS1通过抑制PTEN-AKT信号通路诱导肾透明细胞癌生长和转移

穆中一  
【摘要】:目的:肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)中60~85%为肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)。ccRCC对放化疗均不敏感,靶向治疗和早期诊断是提高ccRCC生存率的重要手段。肌动蛋白纤维相关蛋白1-反义RNA1(actin filament-associated protein 1-antisense RNA1,AFAP1-AS1)在人类消化系统肿瘤存在异常高表达,并与肿瘤患者不良预后密切相关。本研究分析了AFAP1-AS1在ccRCC生长和转移中的作用,并对相关分子机制进行探讨,以期为ccRCC寻找新的分子治疗靶点。研究方法:研究对象包括人ccRCC组织60例、癌旁组织20例、人肾小管细胞HK-2以及人肾透明细胞癌细胞786-O、Caki-1、ACHN、A498。采用real-time PCR检测AFAP1-AS1和PTEN在人ccRCC组织和癌旁组织中表达,检测AFAP1-AS1在HK-2细胞、ccRCC细胞及小鼠肿瘤组织中的表达。采用AFAP1-AS1 shRNA(shAF)慢病毒载体分别转染ccRCC细胞,下调AFAP1-AS1表达。采用CCK-8法检测ccRCC细胞活力。采用western blot检测增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、Vimentin、E-cadherin、PTEN、pAKT、AKT在ccRCC细胞和小鼠肿瘤组织中的表达。采用transwell法分析ccRCC细胞迁移及侵袭能力。采用PTEN siRNA(siPTEN)转染ccRCC细胞,下调PTEN表达。采用免疫缺陷小鼠构建移植瘤模型,观察肿瘤生长和转移。采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,数值表示为均数±标准差(mean±SD)。两个样本间比较,采用t检验。利用Kaplan-Meier法分析生存率,采用log-rank检验对生存率进行比较。采用Pearson检验进行相关性分析。P0.05为差异有统计学意义。结果:1、AFAP1-AS1在ccRCC组织中的表达水平高于癌旁组织。AFAP1-AS1表达水平分别与肿瘤TNM分期、淋巴结转移及预后具有相关性。2、AFAP1-AS1在Caki-1、ACHN和A498细胞中的表达水平均高于HK-2细胞。shAF慢病毒载体稳定转染下调AFAP1-AS1在ccRCC细胞中的表达。3、AFAP1-AS1促进ccRCC细胞增殖。(1)shAF转染ccRCC细胞活力低于shNC转染细胞。(2)shAF转染ccRCC细胞PCNA表达水平低于shNC转染细胞。4、AFAP1-AS1诱导ccRCC细胞发生上皮间质转换(epithelial-mesenchymal transition,EMT),促进ccRCC细胞迁移及侵袭。(1)shAF转染ccRCC细胞迁移及侵袭能力均低于shNC转染细胞。(2)shAF转染ccRCC细胞Vimentin表达水平低于shNC转染细胞,而E-cadherin表达水平高于shNC转染细胞。5、AFAP1-AS1抑制PTEN-AKT信号通路。(1)PTEN mRNA在ccRCC组织中的表达水平低于癌旁组织,并与AFAP1-AS1表达水平具有负相关性。(2)shAF转染ccRCC细胞PTEN表达水平高于shNC转染细胞,而pAKT表达水平则低于shNC转染细胞。6、PTEN介导AFAP1-AS1对ccRCC增殖、迁移及侵袭的诱导作用。(1)shAF+siPTEN ccRCC细胞活力高于shAF细胞。(2)shAF+siPTEN ccRCC细胞迁移及侵袭能力均高于shAF细胞。7、PTEN通过PCNA和EMT介导AFAP1-AS1对ccRCC增殖、迁移及侵袭的诱导作用。(1)shAF+siPTEN ccRCC细胞E-cadherin和PTEN表达水平低于shAF细胞,而Vimentin、PCNA及pAKT表达水平高于shAF细胞。8、AFAP1-AS1促进小鼠移植瘤生长及转移。(1)shAF转染ccRCC细胞接种鼠肿瘤组织AFAP1-AS1表达水平低于shNC转染细胞接种鼠。shAF转染细胞接种鼠肿瘤大小及重量均低于shNC转染细胞接种鼠。(2)shAF转染细胞接种鼠肺部转移发生率明显低于shNC转染细胞接种鼠。(3)shAF转染细胞接种鼠肿瘤组织中E-cadherin和PTEN表达水平高于shNC转染细胞接种鼠,而Vimentin、PCNA及pAKT表达水平低于shNC转染细胞接种鼠。结论:1、AFAP1-AS1在ccRCC中过度表达,并与ccRCC分期、淋巴结转移及不良预后相关,表明AFAP1-AS1可作为判断ccRCC预后的标记物分子。2、AFAP1-AS1在ccRCC细胞表达下调后,体外ccRCC细胞增殖、迁移及侵袭能力显著降低;在体ccRCC细胞移植瘤生长和转移显著减弱,表明AFAP1-AS1能诱导ccRCC细胞生长和转移,发挥促癌作用,提示AFAP1-AS1可作为防治ccRCC一个新靶点。3、AFAP1-AS1在ccRCC细胞表达下调后,PTEN表达增多,pAKT表达下降;而PTEN表达敲减能够部分恢复AFAP1-AS1的促癌作用,表明PTEN-AKT信号通路介导了AFAP1-AS1对ccRCC细胞生长及转移的诱导过程。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R737.11

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