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《中国医科大学》 2018年
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转录因子ZNF326调控ERCC1表达促进非小细胞肺癌的增殖

吴晶晶  
【摘要】:目的:肺癌是世界上最常见的肿瘤之一,在所有的恶性肿瘤中,肺癌的死亡率最高,并且在发展中国家其发病率有快速上升的趋势。近年来,越来越多研究表明多种C2H2型锌指蛋白与肺癌的发生发展密切相关。而ZNF326则是一种新近被发现的C2H2型锌指蛋白,然而,目前对于ZNF326在肺癌中发挥的作用尚未有研究报道,而在三阴性乳腺癌的相关研究中其作为一个抑癌基因发挥作用。研究发现ZNF326在三阴性乳腺癌细胞系中为低表达,干扰ZNF326的表达后不仅可上调与EMT和癌症干细胞相关的基因表达,而且可以促进裸鼠皮下的成瘤能力。众所周知,不同的锌指蛋白分子可能发挥着促癌或抑癌的不同作用,而同一种锌指蛋白在不同的肿瘤中也可能发挥着相反的作用。ZNF326蛋白的分子结构(含有转录激活区和C2H2锌指结构)特点具备了作为转录因子的可能性,然而其调控的靶基因却一直不清楚。如果ZNF326可以作为一个转录因子,那么它在肺癌的发生发展中发挥什么作用,究竟是一个癌蛋白还是一个抑癌蛋白以及其作用的靶基因和调控的机制等问题成为了我们实验研究的出发点。本文通过结合体内外的试验结果,旨在揭示ZNF326作为转录因子在非小细胞肺癌发生发展中发挥的作用及其相关作用的分子机制。研究方法:本研究主要通过染色质共沉淀测序的方法,分别对使用ZNF326抗体及Myc-tag标签抗体共同结合的DNA片段进行测序分析,然后筛选出位于启动子区DNA片段的可能靶基因。双向调控ZNF326的蛋白表达后,用RT-PCR检测潜在靶基因的m RNA变化水平,萤光素酶报告基因及凝胶迁移实验等方法明确其与靶基因的具体结合序列。建立稳定转染ZNF326质粒和sh ZNF326干扰序列的H1299细胞系,并将其注入裸鼠皮下,观察其皮下成瘤能力;并通过体外克隆形成、细胞增殖、流式细胞学、基质胶侵袭、免疫印迹实验检测在双向调控ZNF326蛋白表达后H1299和A549细胞在细胞增殖能力、迁移能力以及周期和迁移相关蛋白的变化,并验证该作用是否通过其靶基因ERCC1发挥作用。结果:1、ZNF326在体内外均具有促进非小细胞肺癌增殖的作用:转染ZNF326质粒的H1299细胞组所形成的移植瘤体积、重量明显大于对照组(p0.05),转染sh-ZNF326组的H1299细胞移植瘤体积和重量则明显小于注射了sh NC组(p0.05)。转染ZNF326可促进H1299和A549细胞的增殖和克隆形成能力(p0.05),而干扰ZNF326的表达后抑制其增殖和克隆形成能力(p0.05)。ZNF326在支气管上皮及肺泡组织中为阴性表达,在腺癌和鳞癌细胞核中高表达。ZNF326在肺癌组织标本(82/146)中高表达,并且其高表达与非小细胞肺癌的低分化、高p TNM分期密切相关(p0.05)。ZNF326促进非小细胞肺癌迁移能力:转染ZNF326质粒后,A549及H1299细胞的迁移能力增强,而干扰ZNF326表达后其迁移能力侵袭能力均减弱(p0.05)。2、ERCC1是ZNF326的靶基因:ZNF326抗体与Myc-tag标签抗体共同结合的DNA主要位于启动子区、外显子区、内含子区及基因间区,共同片段有278个;转染ZNF326上调ERCC1的m RNA水平,干扰ZNF326的表达,ERCC1的m RNA水平下调(p0.05)。在H1299及A549细胞中转染ZNF326,ERCC1的萤光素酶报告基因活性增强,干扰ZNF326,ERCC1的萤光素酶报告基因活性减弱(p0.05)。ZNF326与ERCC1在正常肺组织中均呈低表达,在腺癌和鳞癌中呈细胞核的高表达且表达呈正相关(r=0.737,p0.05)。3、ZNF326与ERCC1启动子区的(-875bp~-883bp)序列结合:ZNF326与ERCC1启动子区(-875bp~-883bp)序列相互结合。只有保留(-875bp~-883bp)序列ZNF326才能激活ERCC1的转录活。ZNF326的转录激活结构域及C2H2结构域是激活ERCC1转录所必须的。4、ZNF326通过ERCC1调节细胞周期蛋白表达促进G2期向M期转换。转染ZNF326后,Cyclin A2、Cyclin B1、Snail、Slug蛋白水平上调,P21、E-cadherin蛋白水平下调;干扰ZNF326后,Cyclin A2、Cyclin B1、Snail、Slug蛋白水平下调,P21、E-cadherin蛋白水平上调。转染敲除ZNF326转录激活结构域及C2H2结构域剪接体后ERCC1、Cyclin B1蛋白水平明显下降。共同转染ZNF326和ERCC1,ERCC1对ZNF326上调Cyclin B1蛋白水平起协同作用,转染ZNF326的同时干扰ERCC1则该作用消失。同时流式细胞学检测结果显示过表达ZNF326后,进入G2/M期的细胞数量明显增多,干扰后则G2/M期的细胞数目明显减少(p0.05)。5、ERCC1通过Chk1促进Cyclin B1蛋白合成。干扰ZNF326表达,可明显抑制Chk1和Cyclin B1蛋白水平表达;转染ERCC1对ZNF326激活Chk1和Cyclin B1蛋白水平具有协同作用;转染ZNF326同时干扰ERCC1,则该协同作用消失。干扰Chk1蛋白表达后,ZNF326促进Cyclin B1蛋白合成的作用减弱。结论:ZNF326在非小细胞肺癌中高表达,且与其低分化和高TNM分期密切相关。ZNF326作为转录因子通过其C2H2结构域与ERCC1启动子区(-875bp~-883bp)序列结合调控区结合,促进ERCC1转录及翻译,进而上调Chk1-Cylicn B1蛋白水平,促进非小细胞肺癌周期进展,发挥促进非小细胞肺癌细胞增殖的作用。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R734.2

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