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《中国医科大学》 2018年
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抑癌基因ARHI对BGC823胃癌细胞自噬、侵袭转移的影响及机制研究

裘敬平  
【摘要】:目的:胃癌是常见的恶性肿瘤,常常在诊断时发现存在远处转移。胃癌治疗失败常常是广泛侵袭和远处转移所引起的,就是说这种侵袭、转移是主要的治疗失败模式,也是患者主要的死因也是侵袭和转移。因此,提高胃癌整体治疗结局的关键在于阐明胃癌发生侵袭转移的机制并建立控制侵袭转移的有效方法。ARHI是1999年发现的母源性印记抑癌基因,以往研究发现在多种恶性肿瘤中ARHI表达下调,并且参与抑制增殖、抑制迁移、调控细胞周期等。目前,ARHI与胃癌自噬以及侵袭转移关系的系统研究尚未见报告。本研究拟构建ARHI再表达胃癌细胞株,采用体外细胞学实验观察评估ARHI基因对胃癌细胞增殖、自噬、凋亡、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响;采用裸鼠荷瘤模型实验评估ARHI基因对胃癌细胞皮下移植瘤生长及血行播散转移的影响,并探讨相关分子机制,旨在系统完整地阐释ARHI基因调控胃癌细胞生物学行为的作用机制,客观评估其作为抗胃癌侵袭转移治疗新靶点的价值。材料和方法:1、构建ARHI基因稳定高表达胃癌细胞株。常规培养人胃癌细胞株BGC-823、SGC-7901、MKN-45、NCI-N87和人永生化胃粘膜上皮细胞株GES-1。采用Real-Time PCR和Western-Blot方法检测ARHI在胃癌各细胞系中的表达水平,筛选出ARHI低表达细胞系BGC823。高表达穿梭质粒pCMV6-ARHI-AC-GFP及空载对照质粒pCMV6-AC-GFP购于Origene公司,脂质体法转染BGC823胃癌细胞,经G418抗性筛选并挑选荧光阳性克隆,获得ARHI稳定高表达胃癌细胞克隆,并采用Real-Time PCR、Western-Blot和免疫荧光方法验证。2、体外细胞学实验观察评估ARHI基因再表达对BGC823胃癌细胞生物学特性的影响。采用MTT比色实验及克隆形成实验评价增殖能力;采用FCM检测细胞周期及凋亡;采用transwell迁移实验、划痕愈合实验、transwell侵袭实验评价迁移、侵袭能力;采用WB检测LC3B、p62水平评价细胞自噬水平;采用WB评价细胞增殖、自噬、EMT、侵袭转移相关信号通路蛋白表达水平,如ERK1/2和p-ERK1/2、Akt和p-Akt、SP1/VEGF、MIIP、Vemintin、α-catenin、MMP9、p-Stat3等。通过评价胃癌细胞中组蛋白去乙酰化酶抑制剂和甲基转移酶抑制剂对ARHI表达水平的影响,探讨胃癌细胞中ARHI基因失活的原因。3、裸小鼠荷瘤模型实验观察评估ARHI基因对BGC823胃癌细胞皮下瘤生长和血行播散转移的影响。BALB/c-nu裸小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司,周龄4-5周,雄性,体重20-22g。皮下荷瘤模型及尾静脉血行转移模型均设vectorBGC823空载对照组、ARHI-BGC823组,每组5只裸小鼠。收集对数生长期各组细胞,计数细胞数,皮下荷瘤组调整细胞数为每只鼠5×106/200μL接种于裸鼠右侧颈背部皮下,接种4周后处死皮下荷瘤裸鼠,手术取出皮下移植瘤体,称量重量,qRT-PCR及WB法检测皮下瘤体组织中ARHI的表达水平,免疫组织化学染色/HE染色评价ARHI基因对皮下移植瘤LC3B、p62、Ki67、SP1、VEGF、p-AKT等蛋白表达水平的影响。尾静脉血行播散组为每只鼠5×106/100μL进行尾静脉注射,接种8周后处死裸鼠,HE染色评价ARHI基因对BGC823胃癌细胞在肺、肝形成转移瘤能力的影响。4、免疫组化方法评估人胃癌组织中ARHI、P62、LC3B蛋白水平表达与临床病理因素的关系及预后价值。首先收集304例手术切除的胃癌组织标本及配对正常胃粘膜组织标本并记录临床及随访资料。其次,将组织标本制作常规组织蜡块,随后制作病理组织切片以及HE染色,应用组织芯片仪构建组织芯片。行免疫组织化学染色,方法采用PV-9000、DAB显色系统进行评价,检测胃癌及正常胃粘膜组织中目标蛋白的表达水平。结果判定分为阴性(-)和阳性(+)组,判定方法是以免疫反应染色强度乘以阳性细胞所占同类细胞的百分比作为评分结果。统计学分析评估ARHI、LC3B、p62蛋白表达与胃癌临床病理因素及患者预后的关系。5、统计学分析方法:本研究所获得的数据均使用SPSS 17.0软件分析,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)的方法比较计量资料的统计结果,检验水平F=0.05。采用行×列表的χ2检验或Fisher精确检验计数资料的统计结果。采用Kaplan-Meier法进行生存分析并进行log-rank检验,检验水平α=0.05。结果:1、成功构建稳定过表达ARHI基因的胃癌细胞株模型。pRT-PCR检测胃癌细胞系中ARHI mRNA的相对表达量,在MKN-45、SGC-7901、NCI-N87、BGC-823细胞中ARHI表达水平分别是GES-1的2.88、0.97、0.89、0.17倍,选择ARHI基因表达最低的胃癌细胞系BGC823进行ARHI基因转染。经G418抗性筛选并挑选荧光阳性克隆,最终成功获得ARHI稳定高表达胃癌细胞株,命名为ARHI-BGC823。采用Real-Time PCR、Western-Blot和免疫荧光方法验证ARHIBGC823胃癌细胞高表达ARHI mRNA和蛋白。2、ARHI在体外可显著抑制BGC823胃癌细胞的恶性生物学行为。ARHI基因再表达可诱导BGC823胃癌细胞自噬及凋亡、抑制增殖、阻滞细胞于G0/G1期,抑制癌细胞迁移、侵袭,可能通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路进而诱导细胞自噬,通过抑制MMP2、MMP9表达降低细胞侵袭能力。胃癌细胞中ARHI基因的低表达可能与启动子甲基化、组蛋白去乙酰化相关。3、ARHI在体内显著抑制胃癌细胞裸小鼠皮下移植瘤生长和血行播散转移。裸小鼠皮下成瘤实验结果显示,与对照组相比,ARHI基因再表达可抑制胃癌细胞皮下移植瘤的生长,P0.05。ARHI基因可降低皮下移植瘤的自噬水平,抑制增殖活性,减少血管生成,并抑制p-AKT信号通路水平。尾静脉注射血行播散实验结果显示,与对照组相比,ARHI基因再表达能抑制血行播散胃癌细胞的肝、肺转移,P0.05。4、ARHI、p62蛋白表达与胃癌淋巴结转移及患者预后相关。ARHI、LC3B阳性表达率在在胃癌组织中显著低于正常胃粘膜上皮组织,p62阳性表达率显著高于正常胃粘膜上皮组织。胃癌组织中ARHI蛋白表达与LC3B表达呈正相关,但与p62蛋白表达不相关,LC3B蛋白表达与p62蛋白表达不相关。ARHI阳性率在N分期N1-N3患者中低于N0患者,在TNM分期Ⅲ期及Ⅳ期患者中阳性率低于Ⅰ期及Ⅱ期患者;p62阳性率在Borrmann分型Ⅲ型及Ⅳ型患者中阳性率高于Ⅰ型及Ⅱ型患者,在N分期N1-N3患者中高于N0患者;LC3B阳性率在T分期T3及T4患者中低于T1及T2患者。ARHI阴性组患者的5年总体生存率低于ARHI阳性组;p62阴性组患者的5年总体生存率高于p62阳性组患者。结论:1、成功构建ARHI高表达的胃癌细胞株ARHI-BGC823,体外细胞学实验证实,ARHI基因再表达可诱导BGC823胃癌细胞自噬及凋亡、抑制增殖、阻滞细胞于G0/G1期,抑制癌细胞迁移、侵袭。2、裸小鼠皮下成瘤实验证实,ARHI基因再表达可显著抑制BGC823胃癌细胞皮下移植瘤的生长。尾静脉注射血行播散动物实验证实,ARHI基因再表达显著抑制血行播散BGC823胃癌细胞的肝、肺转移瘤形成能力。3、胃癌细胞中ARHI基因的低表达可能与其启动子甲基化、组蛋白去乙酰化相关。ARHI基因抑制胃癌细胞增殖、迁移、侵袭及体内移植瘤生长和血行播散转移的可能机制:通过诱导G0/G1期阻滞、细胞凋亡抑制胃癌细胞增殖;通过抑制PI3KAKT-mTOR信号转导通路诱导细胞自噬;通过上调MIIP、下调MMP2、MMP9表达进而抑制细胞侵袭能力;通过抑制血管生成进而抑制体内胃癌细胞的生长和转移。4、大样本人胃癌组织中ARHI、LC3B蛋白表达显著低于正常胃粘膜上皮组织,而胃癌组织标本中p62蛋白表达水平显著高于正常胃粘膜上皮组织标本。ARHI蛋白在胃癌组织中的表达与LC3B蛋白表达水平呈正相关关系,但与p62蛋白表达水平无相关性;LC3B蛋白表达水平与p62蛋白表达水平无相关性。ARHI蛋白表达水平与胃癌患者发生淋巴结转移和肿瘤的TNM分期具有高度相关性,p62蛋白表达水平与淋巴结转移具有高度相关性;LC3B阳性表达与胃癌在胃壁内的浸润深度呈负相关关系。阳性表达ARHI蛋白的胃癌患者的预后明显好于阴性表达ARHI的胃癌患者,p62表达阳性胃癌患者的预后明显差于p62蛋白阴性肿瘤患者,ARHI和p62分别为影响胃癌患者预后的独立因子。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R735.2

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