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《中国医科大学》 2018年
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锌转运体ZNT1在膀胱癌中的表达意义及发生发展中的影响机制

荆宏伟  
【摘要】:目的:膀胱癌是人类常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内,其在男性中的发生率位居第6,女性则为第16[1,2],常见的95%以上的膀胱癌为尿路移行上皮肿瘤。因其多中心和多器官的发病特点,该病在治疗后易复发。虽然国内外专家学者对膀胱癌进行了广泛的临床和实验研究,仍尚不清楚其发病机理,可以确定的是膀胱癌的发生与发展是多因素作用的结果。当前阶段仍很难对肿瘤患者做到疗效监测以及预后评价。目前有研究发现人体的血锌以及尿锌的含量与膀胱癌的发生发展密切相关,以上的研究结果表明锌的代谢在膀胱癌患者中可能存在异常,肌层浸润性膀胱癌患者的尿锌含量要高于非肌层浸润性膀胱癌患者以及健康人群,研究同时发现肿瘤组织内的锌含量在膀胱癌发生的早期已经发生了下降,我们据此推测在膀胱癌的发生发展过程中,锌的转运可能起到了关键的作用。人体内有200多种酶具有锌指结构,同时锌也是转录因子保持活性并参与细胞结构组成及催化活性的关键元素,是人体必须的微量营养元素之一[3,4]。诸多研究表明发育迟缓、DNA合成受损、免疫功能缺陷、皮肌炎等疾病均与锌缺乏有关,当前研究进一步显示在缺氧、血管生成、细胞增殖和肿瘤转移中,锌相关的一些酶扮有重要角色,表明在肿瘤的发生发展中锌起到至关重要的作用[5]。由SLC30基因编码的ZnT(zinc transporter)蛋白家族和由SLC39基因编码的ZIP(ZRT,IRT-like protein,ZIP)蛋白家族是新近发现的与锌调节相关的两种锌转运蛋白家族,其中ZnT家族主要是通过将锌离子转出细胞或促使锌进入细胞内的囊泡使细胞内锌的浓度下降,而锌铁调控蛋白家(ZIP)族正相反,通过将锌离子转入细胞内或促进细胞囊泡内锌的释放使细胞内锌的浓度增加,通过两种蛋白的协同作用细胞内锌离子的浓度得以维持稳定。多种恶性肿瘤的发生发展均与锌转运体的异常改变存在关系,已经有研究证实了其在乳腺癌和胰腺癌进展中的作用,但有关锌和锌转运体对膀胱癌作用及影响的报道仍较少。本研究旨在明确ZNT1在膀胱癌组织中的表达情况,并通过相应的体外实验探讨ZNT1蛋白在膀胱癌的发生发展中所发挥的作用,为更深一步的研究奠定理论基础。研究方法:1、检测ZNT1在膀胱癌组织的mRNA和蛋白中的表达情况,统计ZNT1基因的表达情况,分析其与膀胱癌临床病理特征间存在的关系以及其在膀胱癌组织中表达的临床意义。(1)通过免疫组化检测了106例膀胱癌患者的组织和23例正常膀胱组织中ZNT1的表达情况;(2)利用Real-time RT-PCR和Western blot法检测膀胱组织中ZNT1的mRNA和蛋白表达情况。2、检测ZNT1在4株膀胱细胞系SV-HUC-Ⅰ(SV)、BIU87、T24及5637中mRNA和蛋白的表达情况,统计分析ZNT1基因分别在正常膀胱细胞系及膀胱癌细胞系中的表达情况,分析其在膀胱癌细胞系中表达的临床意义。(1)免疫荧光方法对膀胱癌细胞系中ZNT1蛋白进行定位;(2)利用Real-time RT-PCR和Western blot法检测膀胱细胞中ZNT1的mRNA和蛋白表达情况。3、采用RNA干扰技术,将ZNT1-siRNA转染至膀胱癌BIU87细胞中,于转染后一定时间内检测ZNT1 siRNA干扰对BIU87细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响。(1)MTT法检测干扰后BIU87细胞的增殖活性;(2)采用Transwell侵袭实验检测干扰ZNT1后BIU87细胞的侵袭能力;(3)采用划痕实验检测干扰ZNT1后BIU87细胞的迁移能力。结果:1、最终免疫组化检测结果提示ZNT1在正常膀胱组织中仅有微弱表达,其表达阳性率为34.8%,而在膀胱癌组织中阳性率高达71.7%,其差异具有显著的统计学意义(P0.01)。同时本研究通过分析ZNT1基因的表达与膀胱癌临床病理指标之间的关系,发现ZNT1基因的表达与患者年龄、肿瘤大小及肿瘤是否进展无明显相关,而与肿瘤的病理级别及肿瘤分期具有相关性(p0.05)。Real Time RT-PCR及Western Blot的结果均提示ZNT1在膀胱癌组织中的表达显著高于正常膀胱组织,其差异具有统计学意义(P0.05)。2、Real Time RT-PCR及Western Blot检测SV、BIU、T24及5637四种细胞株中ZNT1的表达量,结果显示:膀胱癌细胞系中ZNT1表达明显升高,其中在BIU中表达量最高,5637及T24次之,SV最少。免疫荧光检测结果表明ZNT1蛋白主要存在于正常膀胱上皮细胞SV中的细胞质内,细胞核内较少;而在膀胱癌细胞T24及5637中,ZNT1蛋白主要存在于细胞核周围以及细胞核内,在细胞质中表达较少;在膀胱癌细胞BIU87的细胞质和细胞核内均可见ZNT1蛋白的表达,且分布均匀。3、利用前期检测结果我们选择膀胱癌BIU细胞系作为研究对象,瞬时转染ZNT1-siRNA,成功构建沉默ZNT1基因表达的BIU-siZNT1细胞株,应用MTT、Transwell侵袭实验、细胞划痕实验分别检测ZNT1在膀胱癌BIU-siZNT1,BIU-siV及BIU细胞的增殖、侵袭及迁移能力变化情况,结果发现干扰后BIU-siZNT1细胞的增殖、侵袭及迁移能力均显著降低,其差异具有显著统计学意义(P0.001)。结论:1、ZNT1在膀胱癌中mRNA及蛋白水平的表达含量明显比其在正常膀胱组织中的表达量高,提示ZNT1可以作为膀胱癌的一个潜在诊断指标。2、干扰后的BIU87-siZNT1细胞的增殖能力、侵袭能力及迁移能力均显著降低,表明ZNT1很大程度可能是膀胱癌的一个癌基因,在膀胱癌的发生发展过程中ZNT1可能是其中一个重要的调控因子,该结果对后续的研究以及分子靶向治疗奠定了的基础。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R737.14

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