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《中国医科大学》 2018年
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STAT3/mTOR调控的自噬在血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老中的作用及机制

杨爽  
【摘要】:目的:肾脏是衰老最快的器官之一,老龄社会里老年人群慢性肾脏疾病(CKD)发病率逐年增加,肾脏衰老已成为影响国民健康的主要疾病。因此探讨肾脏衰老的机制,延缓肾脏衰老进程,引起国内外学者的关注。细胞衰老是导致年龄相关性疾病的关键环节,是研究器官衰老的重要切入点。多条信号转导通路共同作用调控肾脏的衰老。课题组前期研究表明JAK2/STAT3通路参与了高糖及血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小球系膜细胞的衰老。但对于STAT3激活在血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老中的独特作用及机制尚不清楚。本文拟在前期课题研究基础上对STAT3在血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老中的作用进行深入探讨。由于自噬作为调控衰老的一种重要机制,不同细胞类型不同环境下不同定位的STAT3通过转录或非转录方式激活或抑制细胞自噬。本文着重于自噬调控衰老的机制研究。同时使用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂剂氯沙坦及抗氧化剂普罗布考探讨它们在延缓肾小球系膜细胞衰老过程中的作用及机制,为肾脏病防治,延缓衰老提供依据。材料与方法:1.自噬对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老的调节作用使用血管紧张素Ⅱ作用人肾小球系膜细胞建立衰老模型,通过形态学检测、Westernblot检测衰老相关蛋白p53、p21蛋白表达,β-半乳糖苷酶染色阳性率测定进行细胞衰老鉴定。同时通过电镜检测细胞内自噬体数量及Westernblot检测自噬相关蛋白LC3 Ⅱ、自噬降解底物p62蛋白表达检测自噬活性。对于衰老细胞与自噬抑制剂3MA及自噬诱导剂雷帕霉素,观察对细胞自噬及衰老的影响。2.STAT3/mTOR调控的自噬在血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老中的作用检测衰老细胞STAT3/mTOR通路的表达,对于衰老细胞分别给予STAT3特异性抑制剂S3Ⅰ-201及转染STAT3-siRNA阻断STAT3表达,观察人肾小球系膜细胞电镜下细胞内自噬体数量、β-半乳糖苷酶染色阳性率变化及Western blot法检测各组细胞 STAT3、p-STAT3、LC3Ⅱ、p62、p53、p21、mTOR、p-mTOR 蛋白的表达变化3.氯沙坦、普罗布考调控的STAT3/mTOR活性对血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小球系膜细胞自噬及细胞衰老的影响氯沙坦、普罗布考预处理人肾小球系膜细胞,再予血管紧张素Ⅱ刺激72小时,观察人肾小球系膜细胞电镜下细胞内自噬体数量、β-半乳糖苷酶染色阳性率变化、细胞内活性氧测定及Western blot法检测各组细胞STAT3、p-STAT3、LC3Ⅱ、p62、p53、p21、mTOR、p-mTOR蛋白的表达变化结果:1.自噬对血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老的调节作用血管紧张素Ⅱ作用于人肾小球系膜细胞72小时β-半乳糖苷酶染色阳性率达83.74±5.37%,明显高于正常对照组23.15±5.39%。衰老相关蛋白p53、p21表达在72小时明显高于正常对照组,呈现衰老表型。在血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老过程中,自噬相关蛋白LC3Ⅱ蛋白呈时间依赖性表达增加,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显高于正常对照组。自噬降解底物p62/SQSTM1随血管紧张素Ⅱ刺激时间延长逐渐下降。透射电镜显示血管紧张素Ⅱ作用72小时细胞内自噬泡数量明显多于正常对照组(43.50±9.42vs23.00±12.25,P0.01)。同血管紧张素Ⅱ组相比,自噬抑制剂3MA减少了血管紧张素Ⅱ诱导的自噬体形成(17.50±3.49vs43.50±9.42,P0.01),降低β-半乳糖苷酶染色阳性率(34.95±9.18vs68.52±7.45,P0.01),明显减少血管紧张素Ⅱ诱导的LC3Ⅱ的表达,降低LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值,使p62蛋白表达增加,明显降低p53、p21蛋白表达。雷帕霉素虽使血管紧张素Ⅱ作用下人肾小球系膜细胞内自噬体数量进一步增加,增强血管紧张素Ⅱ组LC3Ⅱ的表达,提高LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ值,但对于p62、p53、p21蛋白表达及β-半乳糖苷酶染色无明显影响。2.STAT3/mTOR调控的自噬在血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老中的作用血管紧张素Ⅱ作用于人肾小球系膜细胞,STAT3、p-STAT3表达增加,伴随mTOR通路的活性逐渐下调,72小时p-mTOR几乎失活。血管紧张素Ⅱ+S3Ⅰ-201组、血管紧张素Ⅱ+STAT3-siRNA组和血管紧张素Ⅱ组细胞内自噬体数量分别为22.00±10.71,16.50±9.39和43.50±9.42,差异具有统计学意义(p0.01)。血管紧张素Ⅱ+S3Ⅰ-201组、血管紧张素Ⅱ+STAT3-siRNA组和血管紧张素Ⅱ组细胞内β-半乳糖苷酶染色阳性率分别为55.26±12.53%,52.90±7.81%和68.10±7.45%,差异具有统计学意义(p0.05)。与单纯血管紧张素Ⅱ组相比,使用S3Ⅰ-201及转染STAT3-siRNA沉默STAT3表达,均可明显下调LC3Ⅱ的表达,降低LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ比值,而p62蛋白表达增加,p53、p21表达减少,mTOR及p-mTOR表达增加。3.氯沙坦、普罗布考调控的STAT3/mTOR活性对血管紧张素Ⅱ诱导的HGMC自噬及细胞衰老的影响氯沙坦组和普罗布考组细胞内自噬体数量分别为14.00±13.57和20.00±11.60,均明显低于血管紧张素Ⅱ组43.50±9.42(p0.01)。氯沙坦组和普罗布考组β-半乳糖苷酶染色阳性率分别为54.87±7.83%和48.11±6.13%,均明显低于血管紧张素Ⅱ组68.10±7.45%(p0.01)。NAC、氯沙坦及普罗布考预处理后均明显抑制细胞内活性氧的产生(P0.01)。单纯应用氯沙坦、普罗布考对正常年轻细胞LC3Ⅱ、p62、p53、p21蛋白表达无明显影响,但在应用血管紧张素Ⅱ刺激72小时条件下,氯沙坦、普罗布考均可明显减少LC3Ⅱ蛋白表达,降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值,并增加p62蛋白表达,明显抑制血管紧张素Ⅱ导致的衰老相关蛋白p53、p21蛋白的表达,抑制STAT3活化,恢复mTOR活性。结论:1、血管紧张素Ⅱ诱导人肾小球系膜细胞衰老过程中,自噬活性增强。自噬抑制剂3MA通过抑制自噬减轻血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小球系膜细胞衰老,自噬诱导剂雷帕霉素激活自噬,对血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小球系膜细胞衰老无明显影响。2、S3Ⅰ-201及STAT3-si-RNA特异性沉默STAT3表达,可恢复mTOR活性抑制血管紧张素Ⅱ诱导的HGMC自噬,延缓细胞衰老。3、氯沙坦及普罗布考减轻氧化应激反应,通过调控STAT3/mTOR活性减轻血管紧张素Ⅱ诱导的HGMC自噬,从而延缓细胞衰老
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R692

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