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《中国医科大学》 2018年
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急性肝衰竭肝性脑病模型中TNF-α对脑组织氨转运体表达的影响

王文  
【摘要】:目的:急性肝衰竭(ALF)可由多种原因引起的一种综合征,表现为大量肝细胞坏死及(或)严重肝功能障碍,短期内患者可发生肝性脑病。ALF是严重危害人类健康的疾病。肝性脑病(HE)是ALF晚期最常见的致死性并发症,其发病机制迄今尚未完全阐明,目前已提出多种学说。其中高血氨被认为是最关键的因素之一。氨是一种弱碱,在生理性pH 7.4时,氨发生质子化,98%以上以NH_4~+的形式存在。游离的NH_3是脂溶性的,可以被动通过细胞膜。近年研究发现,氨的转运,除了伴随着浓度梯度的被动扩散之外,还有NH_4~+/NH_3的主动转运蛋白参与其中。哺乳动物中的氨转运蛋白,即Rhesus相关糖蛋白是近年来研究较多的氨转运体,尤其RhBG/Rhbg和RhCG/Rhcg在肾脏氨分泌中的作用已通过基因敲除等实验得出初步结论。而ALF导致的HE中,尚不清楚脑组织中是否存在NH_4~+/NH_3的主动转运蛋白。本研究通过建立ALF所致肝性脑病小鼠模型,利用蛋白免疫印迹及RT-PCR等方法,初步探讨氨转运体是否参与了肝性脑病时氨引起的中枢神经系统毒性。TNF-α在多种病因导致的急性肝衰竭的发生中有重要作用,这在患者及实验模型中都得到证实。近年研究显示TNF-α与HE的发生机制密切相关,有研究显示,TNF-α增加氨在中枢神经系统源性内皮细胞的扩散,增加脑内的氨浓度,增加氨的中枢神经系统毒性。本研究通过观察ALF所致的肝性脑病小鼠模型中TNF-α水平变化以及阻断TNF-α后脑组织氨转运体蛋白及mRNA的表达变化,探讨TNF-α是否介导了氨通过血脑屏障进入中枢神经系统引起肝性脑病的过程。BBB由大脑毛细血管内皮细胞及其紧密连接复合物组成。BBB是一层连续覆盖在99%脑毛细血管腔表面的内皮细胞膜。本研究通过培养人脑微血管内皮细胞(HBMEC),并加入人TNF-α,观察TNF-α对于HBMEC中氨转运体表达的直接作用,初步探讨TNF-α影响脑组织氨转运体表达的机制。材料与方法实验动物为C57BL/6小鼠,随机分为8组。1组:生理盐水对照组(0h);2组:D-GalN 300 mg/Kg对照组;3组:LPS对照组;4组:D-GalN+LPS组;5组:D-GalN+TNF-α组;6组:TNF-α对照组;7组:D-GalN 600 mg/Kg对照组;8组:抗TNFαIgG抗体组(抗TNFαIgG抗体+D-GalN+LPS)。1组为0小时组,2-5组分为5个时间点(2h、6h、9h、12h、24h),6-8组以12小时为观察时间点。每个时间点5只存活小鼠,留血、肝组织和脑组织待检。1、应用生化学方法检测小鼠血清中的ALT水平,并对肝组织进行HE染色,明确肝细胞坏死的程度和生化学改变。2、利用氨检测试剂盒,检测脑实质氨及血氨水平。3、利用ELISA法检测血清TNFα水平。4、应用Western Blot方法对脑组织氨转运体Rhbg、Rhcg的蛋白表达作半定量分析。5、应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法对脑组织氨转运体Rhbg、Rhcg mRNA的表达作相对定量分析。6、应用免疫组化和免疫荧光法观察小鼠脑组织Rhcg表达部位。结果1、急性肝衰竭小鼠模型的建立D-GalN+LPS组小鼠注射后,出现懒动,摄水和觅食动作减少,6小时ALT水平明显升高,6h死亡率28%(18/65),9h及12 h的肝组织学表现为出血性的亚大块或大块坏死,24h死亡率达60%。使用TNFα代替LPS与D-GalN联合注射后,小鼠出现以上相似的表现、ALT及肝脏组织学改变。应用抗TNFαIgG抗体预先阻断后,动物死亡率显著下降,血清ALT及肝组织病理学明显改善。2、血氨及脑氨水平测定D-GalN联合LPS小鼠血氨水平从6小时即开始升高(P0.01),9h和12h达到高峰(P0.01),24小时开始降低,但较NS对照组仍显著升高(P0.01)。脑组织氨水平从2小时开始升高,12小时达到高峰,24小时降至正常。D-GalN联合TNFα腹腔注射后,2小时血氨及脑氨水平开始升高,9小时血氨和脑氨水平均达到高峰,12小时血氨和脑氨水平开始下降,但较生理盐水对照组、D-GalN 12h对照组和TNF-α12h对照组仍明显升高,24小时组血氨仍有升高,但脑组织氨已降至正常水平。3、血清及脑组织TNFα表达D-GalN+LPS组小鼠血清TNF-α水平2小时明显升高,达到497.37±279.94pg/ml,6小时开始下降,9小时降低至112.51±46.90 pg/ml,12小时降至正常水平。LPS对照组血清TNF-α水平2小时明显升高,达到314.91±59.76 pg/ml(P0.01vs NS group),6小时即降至正常水平,此后未再升高。D-GalN+LPS组12小时脑组织TNF-α显著升高。4、脑组织及HBMEC中氨转运体的表达D-GalN+LPS组及D-GalN+TNF-α组小鼠各时间点脑组织氨转运体Rhbg蛋白及mRNA表达未见明显变化,Rhcg mRNA表达于2小时开始升高,Rhcg蛋白分别于6小时(D-GalN+LPS组)及2小时(D-GalN+TNFα组)开始增加,12小时mRNA及蛋白表达量最高。Rhcg主要表达于小鼠脑血管内皮细胞和星形胶质细胞。人脑微血管内皮细胞加入TNF-α后,氨转运体RhBG和RhCG于12小时及24小时均出现蛋白及mRNA水平的表达升高。5、TNF-α对脑组织氨转运体表达的影响抗TNFαIgG抗体预先阻断后,可明显下调D-GalN+LPS组12小时氨转运体Rhcg的蛋白及mRNA表达,而Rhbg的蛋白及mRNA表达未见明显变化。结论1、雄性C57BL/6小鼠给予D-GalN联合LPS或D-GalN联合TNF-α腹腔注射成功诱导ALF动物模型,血氨及脑氨水平明显升高,成功构建小鼠HE模型。2、ALF肝性脑病动物模型中血清TNF-α水平升高,阻断TNF-α可以改善肝衰竭死亡率,改善肝脏组织学,并显著降低HE模型中血氨和脑氨水平。3、ALF肝性脑病动物模型中脑组织氨转运体Rhbg表达未见明显改变,但Rhcg蛋白及mRNA表达升高,与血氨及脑氨升高的时间相一致,Rhcg可能起到促进氨由血脑屏障进入脑实质、进而引起星形胶质细胞肿胀和神经元的毒性作用。阻断TNF-α可以下调脑组织Rhcg mRNA和蛋白表达,从而降低氨引起的中枢神经系统毒性。4、体外实验表明,TNF-α可引起脑血管内皮细胞Rhbg、Rhcg在蛋白及mRNA水平的表达增加。TNF-α引起脑组织中氨转运体表达变化的机制尚需进一步研究。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R575.3;R-332

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