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《中国医科大学》 2018年
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Mg-2Zn-0.5Nd合金干预大鼠骨骼肌细胞粘附和细胞内BMP-2/FoxO1活性的作用及其分子机制

卢伟  
【摘要】:目的:近年来,镁合金因其可降解性和生物力学相容性而越来越受到人们的重视。但是镁合金在生理环境中降解过快,并且在降解过程中产生的氢阻碍组织愈合,限制了其在临床的应用。目前提高镁合金耐腐蚀性的主要方法之一就是合金化。中国科学院金属研究所开发出一种新的镁合金Mg-2Zn-0.5Nd合金,并且他们已经对其进行了金属材料强度等相关研究。在此基础上我们将进一步研究Mg-2Zn-0.5Nd合金对细胞和组织的影响,通过在体及离体实验观察它的生物相容性和耐腐蚀性。大鼠骨骼肌细胞是目前细胞毒性实验中常用的细胞,具有易培养、传代稳定及生长迅速等优点。在本实验中我们将研究Mg-2Zn-0.5Nd合金对大鼠骨骼肌粘附的影响,并且进一步研究Mg-2Zn-0.5Nd合金对大鼠骨骼肌BMP-2和FoxO1活性的影响,并探讨其分子机制。同时大鼠本身具有生长快,繁育性能好的优点,被广泛用于材料的体内安全性实验。我们在体内实验中将Mg-2Zn-0.5Nd合金植入到大鼠的肌肉内,观察合金材料对肌肉组织的影响。研究方法:本研究通过体内实验和体外实验两方面来研究。体外实验:实验分为4组,分别为正常对照组、317L合金组、Ti-6Al-4V合金组、Mg-2Zn-0.5Nd合金组。其中正常对照组选择为同样形状的玻片,余各实验组分别为各对应合金材料。使用24孔培养板培养大鼠骨骼肌细胞,将消毒后的合金材料放入培养板,每组细胞分别培养2h、6h和12h后,计算粘附率。同时使用6孔培养板培养大鼠骨骼肌细胞,将合金材料放入6孔培养板中,在每组细胞培养24h后,进行荧光染色,观察不同材料表面细胞的粘附情况。按照国际标准化组织的标准(ISO10993-5:2009)进行三种不同的金属材料317L合金、Ti-6Al-4V合金和Mg-2Zn-0.5Nd合金浸提液的制备。传代培养大鼠骨骼肌细胞后,用浸提液培养大鼠骨骼肌细胞。分别培养1d、3d和5d后,CCK-8法检测细胞增殖活力。取浸提液培养24h的大鼠骨骼肌细胞,进行蛋白提取,测定蛋白浓度,通过Western blot检测BMP-2、FoxO1、p-FoxO1、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、P38及p-P38的表达,并对条带灰度进行分析。应用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示,对数据进行正态性和方差齐性检验,多组间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验法。P0.05表示差异有统计学意义。体内实验:实验动物为健康雄性清洁级SD大鼠,共40只,分为4组,分别为正常对照组、317L合金组、Ti-6Al-4V合金组和Mg-2Zn-0.5Nd合金组。选择每只大鼠的双后肢作为实验部位。正常对照组不植入材料,317L合金组、Ti-6Al-4V合金组和Mg-2Zn-0.5Nd合金组分别植入对应金属丝。腹腔麻醉后,将50ml注射器针头插入大鼠后肢肌肉内,将各合金植入材料沿针头插入肌肉组织中。植入手术2周和4周后抽血检测镁离子浓度。手术4周后取出植入材料周围组织。石蜡包埋,HE染色,光学显微镜下观察组织中炎性细胞浸润程度、纤维化程度及组织细胞变性坏死情况。同时进行免疫组织化学染色,显微镜下观察结果,并使用Quantimet970图像分析系统,每组随机抽取10张切片,测量大鼠骨骼肌细胞BMP-2阳性反应产物的平均灰度值。平均灰度值越小,表示阳性反应越强烈。应用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析。计量资料用均数±标准差(x±s)表示,对数据进行正态性和方差齐性检验,多组间的比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验法。P0.05表示差异有统计学意义。手术4周后取出植入合金材料,喷金电镜扫描,观察材料腐蚀情况。结果:体外实验:各组材料表面大鼠骨骼肌细胞2h、6h和12h粘附率比较,不同时间点Mg-2Zn-0.5Nd组细胞粘附率高于正常对照组、317L合金组和Ti-6Al-4V组,且差异有统计学意义(P0.05),而正常对照组、317L合金组和Ti-6Al-4V组间差异无统计学意义(P0.05)。荧光显微镜图片显示大鼠骨骼肌细胞在各组材料表面接种24 h后,细胞在各合金材料表面均有贴附。细胞计数后可见Mg-2Zn-0.5Nd合金组细胞粘附荧光高于正常对照组、317L合金组和Ti-6Al-4V合金组,且差异有统计学意义(P0.05)。结果提示Mg-2Zn-0.5Nd合金可以促进大鼠骨骼肌细胞粘附。通过细胞增殖活力实验可以看出,在1d、3d和5d各个不同的时间点,Mg-2Zn-0.5Nd合金组细胞相对增殖率均高于正常对照组、317L合金组和Ti-6Al-4V合金组,且差异均有统计学意义(P0.05),而正常对照组、317L合金组和Ti-6Al-4V合金组组间差异无统计学意义(P0.05)。结果提示Mg-2Zn-0.5Nd合金可以增加大鼠骨骼肌细胞增殖活力。大鼠骨骼肌细胞使用各组对应培养基培养24小时后,Western blot检测的各组蛋白表达,可见Mg-2Zn-0.5Nd合金组的BMP-2蛋白最多,且Mg-2Zn-0.5Nd合金组与正常对照组、317L合金组和Ti-6Al-4V合金组比较均具有统计学差异(P0.05),而正常对照组、317L合金组和Ti-6Al-4V合金组之间比较无显著性差异(P0.05)。骨骼肌中有大量FoxO1表达,它们对骨骼肌细胞的粘附增殖都有影响。我们在本次实验中通过免疫印迹法研究Mg-2Zn-0.5Nd对FoxO1蛋白活化的影响。Mg-2Zn-0.5Nd和Ti-6Al-4V合金组显著增加了p-FoxO1蛋白的表达,但用317L合金的浸提液共培养不影响p-FoxO1蛋白的表达。同时317L合金、Ti-6Al-4V合金和Mg-2Zn-0.5Nd合金均对t-FoxO1的表达无明显影响。t-mTOR蛋白在各组间均有表达。但t-mTOR在正常对照组、317L合金组、Ti-6Al-4V合金组和Mg-2Zn-0.5Nd合金组的表达无统计学差异(P0.05)。p-mTOR是mTOR的活性形式。p-mTOR在四组均有表达,且正常对照组、317L合金组、Ti-6Al-4V合金组和Mg-2Zn-0.5Nd合金组表现为逐渐增强。但正常对照组、317L合金组和Ti-6Al-4V合金组之间相比较,差异无统计学意义(P0.05)。而Mg-2Zn-0.5Nd合金组与对照组、317L合金组和Ti-6Al-4V合金组比较具有统计学差异(P0.05)。t-AKT在各组间的表达无统计学差异(P0.05)。p-AKT是AKT的活性形式。p-AKT蛋白在Mg-2Zn-0.5Nd组较正常对照组显著升高(P0.05),而与317L合金或Ti-6Al-4V合金共培养不影响p-AKT蛋白的表达。这些结果表明,Mg-2Zn-0.5Nd可能通过AKT-mTOR通路影响大鼠骨骼肌细胞。为了进一研究Mg-2Zn-0.5Nd影响细胞粘附的信号通路。通过Western blot方法检测的各组P38蛋白表达情况,4组细胞均有p-P38和t-P38蛋白的表达,但无显著性差异。这些数据表明,P38/MAPK通路可能不参加Mg-2Zn-0.5Nd对大鼠骨骼肌细胞的粘附的影响。体内实验:手术4周后HE染色观察材料周围肌肉组织情况,可见合金材料植入4周后,正常对照组肌肉组织形态良好,未见组织坏死情况,局部无炎症细胞浸润。317L合金组、Ti-6Al-4V合金组和Mg-2Zn-0.5Nd合金组局部未见组织坏死情况,局部可见多核巨细胞和纤维母细胞增生,周围肌肉组织形态良好。手术4周后合金材料周围肌肉组织免疫组织化学染色,可见合金材料植入4周后,正常对照组、317L合金组、Ti-6Al-4V合金组和Mg-2Zn-0.5Nd合金组周围骨骼肌卫星细胞BMP-2表达呈阳性。通过图像分析系统可见,Mg-2Zn-0.5Nd合金组大鼠骨骼肌卫星细胞BMP-2阳性表达比正常对照组、317L合金组和Ti-6Al-4V合金组多,且差异有统计学意义(P0.05)。手术4周后,电镜扫描观察植入的合金材料,观察合金材料腐蚀情况。可见317L合金、Ti-6Al-4V合金和Mg-2Zn-0.5Nd合金连续性良好,317L合金表面可见不均匀腐蚀,材料表面凹凸不平。Ti-6Al-4V合金表面未见明显腐蚀,材料表面形体良好。可降解材料Mg-2Zn-0.5Nd合金同样出现腐蚀情况,但表面腐蚀表现为均匀的龟裂、腐蚀退变,与317L合金比较,Mg-2Zn-0.5Nd合金表现为均匀性腐蚀退变。结论:体外研究表明Mg-2Zn-0.5Nd合金通过AKT-mTOR通路影响BMP-2蛋白进而促进大鼠骨骼肌细胞的粘附。同时其具有良好的细胞相容性。体内研究表明Mg-2Zn-0.5Nd合金在体内可促进骨骼肌卫星细胞BMP-2表达,同时对肌肉组织具有良好的组织相容性。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R318.08

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【相似文献】
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