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《中国医科大学》 2018年
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血浆外泌体长链非编码RNAs与肺癌诊断的相关性研究

滕云  
【摘要】:肺癌是全世界死亡率最高的癌症。2015年中国约有429.2万癌症新发病例,281.4万癌症死亡病例。其中,肺癌以73.3万新发病例(占整体17.1%)、61万死亡病例(占整体21.1%),成为中国人罹癌或因癌致死的最大威胁。肺癌按照癌细胞组织来源分为腺癌(LUAD)、鳞癌(LSCC)、小细胞肺癌(SCLC)、大细胞肺癌等类型,其中肺腺癌和鳞癌占到了大约85%,其5年生存率不足20%。然而,由于传统影像学和病理学的诊断受到多方面的限制,无法实现早期发现的目的。因此,肺癌大部分都是在晚期被诊断,错过了最佳治疗时机,且疗效缓慢并伴随着一系列快速耐药,预后也较差。因而寻找有效的早期诊断和指导预后的标志物对于肺癌的治疗十分重要。血浆或血清肿瘤标志物不仅能够辅助诊断为肺癌的早期发现提供依据,还能监测疗效进行随访观察。美国临床生化委员会(NACB)和欧洲肿瘤标志物专家组(EGTM)推荐的常用肺癌标志物为癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA),胃泌素释放肽前体(pro-gastrin-releeasing peptide,proGRP),鳞状上皮细胞癌抗原(aquarmous cell carcinoma antigen,SCC),细胞角蛋白19片段(cytokeratin 19 fragment,CYFRA21-1),神经特异性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)。其中NSE和ProGRP主要用于小细胞肺癌的诊断和预后,而CEA,SCC和CYFRA21-1水平升高有助于诊断包括腺癌和鳞癌的非小细胞肺癌(NSCLC),但这些指标均缺乏特异性。例如,ProGRP在慢性肾衰等小细胞肺癌以外的良性疾病中也可显著升高,CEA在多种恶性肿瘤发生时均升高,且主要应用于消化道肿瘤。此外,肿瘤异质性的存在,也使得血液中的标志物的研究需求更加迫切。因此,发现更好的标志物有助于肺癌的诊断和治疗方案的选择。循环系统中的肿瘤标志物因其无创性且易于重复采集样本,便于监测疾病进程,越来越受到人们关注。在人类基因组中,超过80%的基因被转录为非蛋白编码RNA。这些非编码RNA被分为长非编码RNA(lncRNAs)和小非编码RNA(ncRNAs)。在近期的一项研究证实有5446种lncRNAs存在于人类基因组中,加上之前报道过的数据,lncRNA总数已达到6736种。在过去的20年里,ncRNAs中的微小RNA(miRNAs)发挥功能的分子机制已比较清楚,但是lncRNAs的功能仍然有待研究。目前已发现lncRNAs在生物学许多领域中发挥着重要的作用,如干细胞生物学、个体发育、X染色体失活、神经科学和癌症。然而,总体而言,发现有功能的lncRNAs还是少数。最近研究发现,lncRNAs在不同肿瘤中分别发挥着重要作用,参与多条信号通路的调节。传统观点认为,在自然环境下RNA是不稳定的,但是细胞外的RNA已被证实可以稳定的存在于循环系统中。血浆中的RNA与外泌体等囊泡密切相关使其免受核酸酶的降解。肺癌患者组织中lncRNAs表达已有报道。但其在血浆中的表达情况及其临床意义仍缺少数据支持。为了探索是否可以通过筛选并验证肺癌血浆差异lncRNAs,找到全新的关键lncRNAs作为肿瘤诊断标志物,为肺癌的临床诊疗提供新策略。本课题开展了以下两部分研究:第一部分:血浆长链非编码RNA PVT1在肺腺癌中的诊断价值及来源目的:找出肺腺癌患者血浆中高表达的lncRNA。了解其在血浆中主要存在形式及可能来源。明确其在肺腺癌中的诊断价值。方法:从lncRNADisease数据库中挑选出30条在肺腺癌细胞系或组织中差异表达的lncRNAs。将肺腺癌患者设为实验组(n=26),健康志愿者设为对照组(n=26)。通过qRT-PCR实验检测候选lncRNAs在血浆中表达量,统计分析后找出在肺腺癌中具有显著差异的lncRNAs。进一步以肺腺癌患者血浆(n=202),健康志愿者血浆(n=202),其他肺部疾病患者血浆(n=198)为验证组。验证差异表达的lncRNA。利用ROC曲线计算灵敏度和特异性。统计分析差异表达的lncRNAs与患者临床特征间的相关性。随后通过一系列实验设计并干扰lncRNAs表达,研究差异表达lncRNAs在循环系统中稳定存在形式及可能来源。结果:肺腺癌患者血浆中PVT1表达量相对于健康志愿者显著升高(p0.001),ROC曲线分析显示PVT1对肺腺癌诊断的敏感性和特异性分别为78.85%和78.5%。进一步分析其血浆PVT1与患者临床特征的关系发现其表达可能与肺腺癌肿瘤的远端转移相关。通过对比血浆、血浆外泌体及无外泌体血浆中PVT1表达量,发现其在血浆中主要以外泌体内含物的形式存在。此外,肺腺癌切除术后血浆PVT1表达量明显下调,肺腺癌细胞系培养基中外泌体PVT含量随时间增加,干扰PVT1表达后,释放到细胞外的外泌体中PVT1表达也降低,以上这些结果均表明血浆外泌体PVT1主要来源于肺腺癌细胞。结论:肺腺癌患者血浆中PVT1表达量显著升高,对肺腺癌具有一定的诊断价值。血浆中PVT1表达量与是否伴有远端转移具有相关性。其在血浆中主要以外泌体内含物形式存在,并来源于肺腺癌细胞。综上所述血浆PVT1可能在肺腺癌疾病进展过程中发挥着重要作用,其有望成为一个动态监测肺腺癌患者病情进展的血浆标志物,为肺腺癌的诊断及治疗提供了新思路。第二部分:血浆外泌体长链非编码RNA SOX2-OT和ENSG00000245648在肺鳞癌中的诊断价值目的:在5个GEO数据库中的芯片数据分析结果中找到20个在肺鳞癌肿瘤组织中差异表达的lncRNAs,明确其在肺鳞癌中的诊断价值。方法:利用在5个GEO数据库中的芯片数据分析结果中找到20个在肺鳞癌肿瘤组织中差异表达的lncRNAs。利用qRT-PCR实验在血浆外泌体中检测候选lncRNAs表达量,明确是否存在高表达的lncRNAs。ROC曲线分析计算诊断灵敏度和特异性。统计分析差异表达的lncRNAs与临床特征间的相关性。结果:lncRNA SOX2-OT和ENSG00000245648在肺鳞癌患者血浆外泌体中表达量显著上调(p0.01)。通过ROC曲线分析并与CEA、SCC等标志物比较后发现SOX2-OT对肺鳞癌具有较好的诊断价值,特异性和敏感性分别为73.17%和76%,而ENSG00000245648的灵敏度只有44%。进一步通过与临床信息相关性分析发现血浆外泌体SOX2-OT表达量与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移呈正相关。结论:肺鳞癌患者血浆外泌体SOX2-OT和ENSG00000245648表达量显著升高。血浆外泌体SOX2-OT对肺鳞癌具有较好的诊断价值。血浆外泌体SOX2-OT表达量与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移具有相关性,综上所述血浆外泌体SOX2-OT有望成为潜在的肺鳞癌诊断标志物。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R734.2

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