收藏本站
《中国医科大学》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

Rab14在胰腺癌中过表达,并通过YAP/Bcl-2信号通路调控肿瘤细胞的增殖,侵袭,转移以及化疗耐药性

葛金年  
【摘要】:1目的:胰腺癌恶性程度高,预后差,多因早期转移导致死亡[1]。尽管对于胰腺癌致病过程中遗传方面和表观方面的改变已经有了更为深入的研究[2-6],但发病机制仍不明确,本实验拟行进一步探讨。Rab GTPase家族蛋白Rab14属于小G蛋白中RAS致癌基因亚家族中的一员。该家族蛋白参与调控囊泡运输,信号传导以及各类膜受体在细胞中的循环。Rab家族蛋白在肿瘤的发生和发展过程中参与调控细胞的增殖、侵袭、转化、凋亡等多种生命过程。Rab14已经被报道在多种肿瘤的发展过程中发挥作用,包括卵巢癌、口腔鳞癌、胃癌、肾细胞癌[7-9,11]。但是Rab14在胰腺癌中的表达模式以及临床意义还未见报道。在本次研究中,我们将分析胰腺癌中Rab14的表达模式及临床病理意义,探究Rab14是否可作为胰腺癌的分子标记物;其次,通过调控胰腺癌细胞中Rab14的表达水平,分析Rab14对胰腺癌细胞生物学行为产生的影响及分子生物学机制。2材料与方法2.1组织样本收集中国医科大学附属第一医院于2010-2014年间实施外科手术患者的胰腺癌组织标本103例,患者术前均未接受放化疗。肿瘤病理组织学分类和分化程度根据2017 WHO分类标准进行判定。2.2免疫组织化学样本组织经过包埋并制备样片、染色,对所有样本进行随机检测。2.3细胞培养Bxpc3以及Capan2细胞购买于美国典型培养物保藏中心(ATCC)。培养细胞所用的培养基基为RPMI-1640培养基,包含10%胎牛血清;培养条件为37℃,5%CO_2。2.4细胞转染与干扰转染用Rab14质粒以及阴性对照空载质粒购买于Origene公司,转染试剂为lipo3000;干扰所用SMARTpool siRNA Rab14以及阴性对照Non-targeting siRNA购买于美国Dharmacon公司,干扰试剂为Dharmacon公司生产Dharmafect1reagent。2.5 Western blot收集培养的细胞,并提取细胞的总蛋白;接着采用Bradford法为样本总蛋白定量;将制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE进行蛋白分离;转印于PVDF膜后进行抗体孵育;最后在进行发光并通过凝胶成像系统进行观察并保存。2.6实时荧光定量PCR用Trizol试剂提取样本总RNA;实时荧光定量PCR实验使用SYBR Green master mix试剂盒;PCR实验所用仪器为7500 Real-Time PCR System;内参基因为使用β-actin;目的基因的扩增倍数的测算方法依据2~(-ΔΔCt);本实验重复3次。2.7细胞增殖实验MTT实验:细胞过转染48小时,消化重悬细胞调整细胞密度;96孔板每孔接种100μl,约含1×103个细胞;每孔加入20μl MTT工作液培养4小时;490nm波长下测定各孔光吸收值,以不含细胞的等体积培养基作对照。2.8细胞侵袭转移实验基质胶侵袭实验:细胞悬液加入到transwell上室中,下室中加入含有15%的胎牛血清的1640培养基;孵箱中孵育16小时后,将未穿过基质胶的细胞用棉签擦去,将穿过基质胶的细胞用4%多聚甲醛进行固定;苏木精对细胞进行染色。2.9流式细胞术收集细胞并用PBS进行漂洗;用250μl缓冲液重悬细胞,并用多聚甲醛进行固定;加入5 mg/ml碘化丙啶及Annexin V/FITC,于暗室孵育15分钟;用流式细胞仪进行检测,分析细胞的凋亡水平;加入5 mg/ml碘化丙啶于暗室孵育15分钟,用流式细胞仪进行检测,分析细胞的周期水平。2.10统计分析所有的统计分析均使用SPSS 13.0软件。对Rab14表达和临床病理因素的关系用卡方检验;生存分析采用Kaplan-Meier法,用Log-rank检验判断差异性,其他处理组与对照组之间所得数据采用Student's t检验方法进行分析。P0.05为差异有意义。3结果3.1 Rab14在胰腺癌中的表达通过免疫组织化学方法检测了胰腺癌组织和癌旁胰腺组织中Rab14的蛋白表达情况,Rab14主要定位于细胞浆中,Rab14在胰腺癌组织中高表达。3.2 Rab14在胰腺癌中的临床病理意义Rab14在胰腺癌组织中的高表达水平与肿瘤较高的TNM分期,肿瘤组织学分级以及淋巴结转移显著相关。3.3 Rab14在胰腺癌细胞系中的表达分别选择Bxpc3细胞以及Capan2细胞分别进行Rab14转染以及干扰,并通过western blot方法检测转染以及干扰效率,结果显示转染Rab14后Bxpc3中Rab14表达量显著上调;而在Capan2细胞中,敲除Rab14后,Rab14的表达显著下调。3.4 Rab14促进胰腺癌细胞增殖将经过Rab14转染与干扰的胰腺癌细胞应用于MTT实验以及集落形成实验。MTT实验结果表明,Rab14过表达后,Bxpc3细胞增殖率提高;敲除Rab14后,Capan2细胞的增殖率降低。集落形成实验结果表明,Rab14过表达后,Bxpc3细胞形成的克隆数目增加;敲除Rab14后,Capan2细胞形成的克隆数目减少。3.5 Rab14促进胰腺癌细胞侵袭和转移将经过Rab14转染与干扰的胰腺癌细胞应用于基质胶侵袭实验。侵袭实验结果表明,Rab14过表达后穿膜细胞的数目增加,而Rab14表达缺失后穿膜细胞的数目减少。3.6 Rab14增强胰腺癌细胞的化疗抵抗性将经过Rab14转染以及干扰的胰腺癌细胞系用吉西他滨进行处理,通过流式细胞术检测细胞的凋亡水平发现,Rab14过表达后吉西他滨诱导的Bxpc3细胞凋亡水平降低;而Rab14表达缺失后吉西他滨诱导的Capan2细胞凋亡水平增加。3.7 Rab14调控细胞周期、侵袭、凋亡相关蛋白质的表达水平Rab14调控细胞中周期相关蛋白:Rab14过表达后Bxpc3细胞中cyclingA、cyclingD1、cyclingE、p-Rb、bcl-2表达量上调,p21表达量下调;Rab14表达缺失后,Capan2细胞中cyclingA、cyclingD1、cyclingE、p-Rb、bcl-2表达量下调,p21表达量上调。3.8 Rab14调控胰腺癌细胞中YAP/bcl-2通路活性水平Rab14过表达后Bxpc3细胞中YAP的表达量上调,Rab14表达缺失后Capan2细胞中YAP的表达量下调;Rab14通过促进YAP入核,并通过下游bcl-2抑制胰腺癌细胞凋亡。4结论Rab14在胰腺癌组织中表达量显著上调,并且与胰腺癌较高的TNM分期、肿瘤组织学分级、以及淋巴结转移显著相关。Rab14促进胰腺癌细胞的增殖、侵袭、转移、细胞周期转化并增强胰腺癌细胞的化疗耐药性。Rab14调控胰腺癌细胞周期、侵袭、凋亡相关指标的表达,并激活胰腺癌细胞中YAP/bcl-2信号传导通路。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R735.9

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 孙涛;韩善清;;3D可视化在胰腺肿瘤精准手术的应用[J];医学影像学杂志;2019年01期
2 陈汝福;林青;;胰腺癌个体化诊治[J];中华肝脏外科手术学电子杂志;2018年02期
3 赵玉沛;张太平;曹喆;;胰腺肿瘤诊治的瓶颈与挑战[J];中国实用外科杂志;2018年07期
4 ;上海交通大学医学院附属瑞金医院成功为高龄患者切除胰腺肿瘤[J];上海交通大学学报(医学版);2016年11期
5 李悦康;;胰腺出问题有哪些信号[J];益寿宝典;2018年09期
6 高琳琳;;眼白发黄,可能是胰腺出了问题[J];益寿宝典;2018年04期
7 孙海燕;;超声内镜引导下胰腺肿瘤穿刺活检术的配合及护理[J];健康之路;2016年09期
8 田艳涛;;胰腺癌不可怕,“三级预防”来护驾[J];抗癌之窗;2016年06期
9 卢德虎;田艳涛;;胰腺癌早期为何难以被发现[J];抗癌之窗;2016年05期
10 周丁华;莫鹏;;血糖忽高忽低 当心胰腺癌“敲门”[J];家庭医学;2017年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 於敏;俞世安;厉学民;龚道军;陈军强;;腹腔镜胰腺肿瘤切除术中胰后隧道建立方法的探讨[A];2015年浙江省外科学学术年会暨国家级肝胆胰疾病诊治进展学习班论文汇编[C];2015年
2 王焕民;祝秀丹;秦红;;小儿胰腺肿瘤的外科治疗[A];中华医学会第八次全国小儿外科学术会论文集[C];2010年
3 周小渔;刘朝阳;卢琪;戴翼;;儿童胰腺肿瘤5例临床分析[A];中华医学会第八次全国小儿外科学术会论文集[C];2010年
4 董晓秋;邵小慧;戴全;赵宁;;胰腺肿瘤的超声诊断价值[A];中国超声医学工程学会第九届全国腹部超声医学学术会议论文汇编[C];2012年
5 金肖丹;宋洪亮;陈海川;;腹腔镜治疗胰腺肿瘤(附1例报告)[A];2005年浙江省外科学术会议论文汇编[C];2005年
6 靳大勇;楼文辉;匡天涛;王单松;许雪峰;;胰腺肿瘤根治切除术308例分析[A];中华医学会第十一届全国胰腺外科学术研讨会论文汇编[C];2006年
7 张人超;牟一平;徐晓武;严加费;周育成;金薇薇;黄超杰;;腹腔镜与开腹胰腺肿瘤剜除术的对照研究[A];2014年微创外科学术年会论文汇编[C];2014年
8 牟一平;严加费;徐晓武;彭淑牖;;胰腺肿瘤治疗的发展方向——基于多学科协作的个体化和微创化[A];2012年浙江省外科学学术年会论文集[C];2012年
9 金震东;蔡振寨;李兆申;邹多武;湛先保;陈洁;许国铭;;超声内镜检查术对胰腺肿瘤早期诊断的价值[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(上册)[C];2007年
10 吴育连;;胰腺肿瘤外科诊治进展[A];2007年浙江省外科学学术会议论文汇编[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 特约记者 袁蕙芸;胰腺癌需全程规范个性化管理[N];健康报;2017年
2 记者 陶婷婷;突发糖尿病 要警惕胰腺肿瘤[N];上海科技报;2017年
3 新华社通讯员 顾传龙 新华社记者 张宝印;挑战顽症[N];新华每日电讯;2001年
4 姚春雨 钱勇;解放军总医院腹腔镜下切除胰腺肿瘤[N];中国医药报;2001年
5 李新民;射频消融治疗胰腺肿瘤获成功[N];中国医药报;2002年
6 程守勤;中大医院手术治疗胰腺癌获突破[N];中国医药报;2002年
7 程守勤;中大医院打破胰腺癌治疗禁区[N];中国医药报;2002年
8 韩欣;美抗击胰腺癌的研究获得进展[N];中国医药报;2004年
9 记者 冯卫东;美发现与胰腺癌有关的重要蛋白[N];科技日报;2009年
10 天津医科大学附属肿瘤医院胰腺科主任 郝继辉 整理 李运红 赵迎;怀疑胰腺肿瘤 首选B超检查[N];健康报;2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张水生;胰腺癌临床病理特点及预后/Hsa_circ_0007564:胰腺痛诊断和预后新的标志物[D];北京协和医学院;2018年
2 谢放;miR1271对于胰腺癌的临床诊疗作用及炎症/自噬机制研究[D];山东大学;2018年
3 葛金年;Rab14在胰腺癌中过表达,并通过YAP/Bcl-2信号通路调控肿瘤细胞的增殖,侵袭,转移以及化疗耐药性[D];中国医科大学;2018年
4 陆子鹏;胰腺上皮内瘤变(PanINs)星状细胞激活及其促恶性变的机制研究[D];南京医科大学;2016年
5 熊益程;MicroRNA-30b在胰腺癌干细胞上皮-间质转化中的作用及其机制研究[D];苏州大学;2018年
6 宋禾;TRPV6在胰腺癌增殖和凋亡中的作用及相关机制研究[D];中国医科大学;2016年
7 王秀超;胰腺癌肿瘤细胞PD-L1表达调控机制及联合干预实验研究[D];天津医科大学;2017年
8 刘静;EHF缺失诱导胰腺癌免疫微环境抑制的机制研究[D];天津医科大学;2018年
9 高欲燃;LINC-DYNC2H1-4调控胰腺癌耐药细胞干性形成的机制研究[D];哈尔滨工业大学;2017年
10 王鹏;hsa-mir-196b在胰腺癌中表达及其对胰腺癌生物学行为的影响[D];南京医科大学;2018年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 严光耀;服务器虚拟化在江苏大剧院业务的应用[D];南京邮电大学;2017年
2 许婧;基于极简主义的移动端界面设计研究[D];西安工程大学;2018年
3 樊佩珍;基于新一代测序数据的SNV检测方法研究[D];西安电子科技大学;2018年
4 陈雪莲;放疗诱导的HMGB1在胰腺癌干细胞干性维持中的作用研究[D];江苏大学;2018年
5 岳亚丽;基于Survivin载钆金纳米笼探针在胰腺癌早期诊断中的应用[D];蚌埠医学院;2018年
6 曹通;miR-7调控MAP3K9抑制人胰腺癌进展的研究[D];蚌埠医学院;2018年
7 姜玉洁;GLUT1-Ag@Mn-siRNA探针在胰腺癌靶向诊断及放疗增敏中的应用研究[D];江苏大学;2018年
8 郑伟;GPSM2的低表达对胰腺癌生长及化疗敏感性的影响[D];江苏大学;2018年
9 兰春根;肿瘤源性FOXP3促进胰腺癌侵袭转移的机制研究[D];天津医科大学;2018年
10 周博栋;乏氧微环境中RNF139参与胰腺癌抗凋亡机制的研究[D];天津医科大学;2018年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026