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《中国医科大学》 2018年
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miR-15a/16靶向调控TGF-β信号通路影响前列腺癌LNCaP细胞侵袭的机制研究

金玮  
【摘要】:目的:前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤,发病率在我国居于泌尿系肿瘤第三位。近年来前列腺癌发病率迅速增长,且发病年龄日趋年轻化。侵袭转移是恶性肿瘤的重要生物学特征之一,也是影响肿瘤预后的重要因素。仅仅以其最常见转移方式——骨转移为例,至少有65%-75%的前列腺癌患者发生骨转移,而在死于前列腺癌的患者中,转移率高达85%-100%。明确前列腺癌转移过程中的分子生物学机制,将为前列腺癌的预诊断治疗提供理论基础。微小RNA(micro RNA,miRNA)是转录后调控的重要调节分子。miR-15a/16簇定位于人类染色体13q14.2,既往研究表明该簇在肿瘤发生进展过程中表现出抑癌基因的特性。在前列腺癌中,13q14.2微缺失导致miR-15a/16簇杂合性丢失,尤其在转移性前列腺癌中发生率较高,提示miR-15a/miR-16簇缺失可能与前列腺癌的转移密切相关。TGF-β信号通路是研究前列腺癌转移机制的热点之一,典型通路是TGF-β/Smads信号通路。除此之外,TGF-β超家族中TGF-β、BMP及Activin等信号分子均在肿瘤转移过程中扮演重要的角色,可能是潜在的miR-15a/16调控靶基因。目前,miR-15a/16是否通过调节TGF-β信号通路相关信号分子调控前列腺癌转移尚无明确解释。本研究拟通过生物信息学预测、报告基因实验、real-time PCR和Western blot等方法证实miR-15a/16通过靶向调节TGF-β信号通路相关分子调控前列腺癌转移的机制。研究方法:实验材料:1、人前列腺癌细胞系LNCaP、人胚肾HEK293细胞及培养相关试剂2、基因克隆相关分子生物学试剂3、荧光素酶报告基因检测相关分子生物学试剂4、Real-time PCR及Western blot相关试剂5、Transwell小室及相关试剂实验方法:LNCa P、HEK293细胞培养、基因瞬时转染、Real-time PCR检测mRNA表达、Western blot检测蛋白表达、检测荧光素酶报告基因、Transwell小室检测细胞侵袭力、生物信息学预测、统计学分析。结果:1.生物信息学预测结果显示,Smad3、Smad5、BMPR1A、ACVR2A、ACVR2B编码基因3′-UTR上均潜在miR15a/16的结合位点;2.荧光素酶报告基因检测结果显示:过表达miR-15a/16明显抑制Smad3、ACVR2A3′-UTR报告载体荧光素酶活性,转染抑制剂后可使其活性上升;3.Western Blot和Real-time PCR结果显示,过表达miR-15a/16明显抑制LNCa P细胞内源性Smad3、ACVR2A蛋白水平,但Smad3、ACVR2A m RNA水平没有明显改变;此外,转染miR-15a/16组磷酸化smad3水平表达下调,MMP2蛋白表达下调,EMT诱导因子Snail1、Twist1的m RNA表达下调;4.Transwell小室法检测结果显示,miR-15a/16过表达抑制LNCa P细胞的侵袭。结论:1、miR-15a/16通过与Smad3、ACVR2A 3′-UTR序列靶向结合,在转录后水平抑制基因的表达。2、miR-15a/16通过Activin/smad信号通路调节前列腺癌细胞转移。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R737.25

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