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《中国医科大学》 2018年
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重组人p53腺病毒联合洛铂对Hela细胞生长抑制作用机制及宫颈癌介入化疗的PET/MR疗效评价研究

孙巍  
【摘要】:目的:宫颈癌是严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤,发病率居我国女性生殖系统恶性肿瘤之首。目前宫颈癌介入化疗方案存在部分患者疗效不佳、毒副作用大及肿瘤耐药等问题,本实验拟通过体外细胞实验及裸鼠移植瘤实验探索重组人p53腺病毒联合洛铂诱导宫颈癌Hela细胞凋亡和生长抑制的作用及机制,从而为重组人p53腺病毒联合洛铂方案应用于宫颈癌介入化疗提供理论依据和指导,以期提高介入化疗疗效,减小毒副作用。同时,利用18F-FDG PET/MR一体机对宫颈癌使用重组人p53腺病毒联合洛铂为基础的介入化疗方案的疗效进行影像学评估,初步探讨PET/MR对其疗效评价和预测的价值。研究方法:1、体外实验:首先进行宫颈癌Hela细胞培养与传代,实验分为空白对照组、洛铂组、重组人p53腺病毒组和洛铂+重组人p53腺病毒组。倒置相差显微镜及Hoechst33342染色分析细胞凋亡、观察细胞形态。MTT法检测宫颈癌Hela细胞的活性。流式细胞仪结合AnnexinV-FITC/PI双染检测肿瘤细胞凋亡率。免疫印迹(Western blotting)检测相关蛋白的表达。2、动物实验:4-8周龄体重20~22克BALB/c裸鼠20只(均为雌性),饲养于中国医科大学附属盛京医院中心实验室实验动物中心,维持最适条件。动物实验研究已获得伦理委员会的批准。1×10~7/0.1ml Hela细胞接种于腋窝中部外侧皮下,建立裸鼠皮下移植瘤模型。约两周后,当裸鼠肿瘤体积达到约1cm~3后,将20只造模成功的裸鼠随机分为四组并标记(每组5只),分别接受鼠尾静脉注射治疗:空白组100μl的PBS、100mg/kg洛铂组(100μl)、重组人p53腺病毒组(100μl)和洛铂(100μl)与重组人p53腺病毒(100μl)联合应用组。每隔一天对各组荷瘤鼠用卡尺在体测量瘤体长短径后进行鼠尾静脉注射一次。注射两周以后处死全部裸鼠,小心剥离肿瘤并进行瘤体重量称量。计算抑瘤率、描绘移植瘤生长曲线图、Western blot检测p53等蛋白的表达。3、临床实验:宫颈癌患者使用重组人p53腺病毒联合洛铂为基础的化疗方案介入化疗术前行PET/MR检查,首次介入化疗术后3周结合妇科检查及PET/MR检查,符合手术条件行妇科切除手术,如疗效不理想再行第二次介入化疗或同步放化疗。参照2009年实体肿瘤客观疗效评定标准(RECIST)评价介入化疗有效率,按WHO常见毒性分级标准评价化疗毒副反应(骨髓抑制、胃肠道反应和发热等)。介入术后行切除手术的患者评价宫旁缓解率、手术率和病理高危因素。利用18F-FDG PET/MR对23例重组人p53腺病毒联合洛铂为基础的宫颈癌介入化疗前后的PET/MR图像数据进行分析,以40%SUVmax阈值自动勾画肿瘤边界,PET图像测量术前、术后肿瘤SUVmax、SUVmean及mADC,根据PERCIST标准进行疗效评价,MR图像测量术前、术后肿瘤最大径,根据RECIST标准进行疗效评价。分析各参数之间的相关性,并对比有效组与无效组各参数与疗效的关系。4、统计学处理:实验数据以均数±标准差表示;采用IBM SPSS Statistic 22.0统计学软件进行统计学分析。统计图制作采用GraphPad prism5软件和Office2013 Excel。以P0.05认为有统计学差异。结果:1、体外实验:1.1倒置相差显微镜及Hoechst33342染色结果显示,单独洛铂和重组人p53腺病毒处理细胞不能够产生明显的凋亡反应。二者联合应用则能够诱导大量细胞凋亡。1.2 MTT法检测重组人p53腺病毒的导入显著增敏洛铂诱导的细胞活性抑制作用,洛铂与重组人p53腺病毒联合组细胞活性抑制作用与其他组有显著差异(P0.05)。1.3流式细胞仪结合AnnexinV-FITC/PI双染实验显示单独用洛铂和重组人p53腺病毒处理细胞,均没有明显的凋亡产生,洛铂组细胞凋亡率11.5%,重组人p53腺病毒组凋亡率12.4%,而联合处理组细胞凋亡率达50%以上,表明p53基因导入能够显著增敏洛铂诱导的细胞凋亡,联合处理组与其他各组间凋亡率有统计学差异(P0.05)。1.4 Western blotting显示:重组人p53腺病毒导入增敏了洛铂诱导的细胞内促凋亡蛋白激酶caspase 3,caspase8和PARP切割激活。重组人p53腺病毒导入显著增加了细胞内关键促凋亡蛋白Bak和Bax的表达。重组人p53腺病毒导入能够显著增加洛铂诱导的Hela细胞内癌蛋白Mcl-1切割失活。2、动物实验:2.1洛铂和重组人p53腺病毒联合应用抑制肿瘤生长的效果要明显优于单独注射洛铂、单独注射重组人p53腺病毒溶液。2.2抑瘤率分别为对照组0%、洛铂组37.79%、重组人p53腺病毒组8.43%、洛铂联合重组人p53腺病毒处理组91.70%。重组人p53腺病毒和洛铂联合处理组肿瘤平均瘤重明显小于空白对照组(P0.05),与洛铂和重组人p53腺病毒单独处理组相比较,联合处理组瘤体重量最轻(P0.05)。2.3重组人p53腺病毒联合洛铂诱导了移植瘤内大量的Hela细胞凋亡发生。3、临床实验:3.1宫颈癌患者使用重组人p53腺病毒联合洛铂为基础的介入化疗术总体有效率78.6%,宫旁缓解率60.0%,手术率82.6%。19例手术患者病理高危因素如下:阴道切缘阴性19例(100%),肌层侵润深度1/2者为6例(31.6%),≥1/2者为13例(68.4%),淋巴结转移6例(31.6.%),癌栓转移2例(10.5%)。化疗毒副反应:骨髓抑制9例(39.1%),胃肠道反应8例(34.7%),发热14例(60.9%),肝脏毒性0例。3.2应用RECIST标准和PERCIST标准对宫颈癌介入化疗疗效进行评价总体并无不同(P0.05)。3.3宫颈癌介入化疗术前的SUL与mADC无明显相关性。介入化疗后SUL与mADC、△SUL与△mADC呈负相关。宫颈癌介入化疗前后的TD与SUL及它们的变化值之间存在相关性。TD与mADC只在术前呈负相关。3.4有效组与无效组介入化疗前的TD、SUL及介入化疗前后的mADC差异不明显(P0.05),有效组与无效组介入化疗后TD、SUL值有明显差异(P0.05),有效组与无效组间△mADC、△TD值、△SUL均有明显差异(P0.05)。结论:1、重组人p53腺病毒能够显著增敏洛铂诱导体外宫颈癌Hela细胞凋亡和活性抑制。2、重组人p53腺病毒能够显著增强洛铂对裸鼠Hela细胞移植瘤的生长抑制作用。3、重组人p53腺病毒联合洛铂为基础的宫颈癌介入化疗有较好的临床疗效。4、PET/MR对宫颈癌介入化疗的疗效评价及预测有重要价值。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R737.33;R445.2;R730.44

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