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《中国医科大学》 2018年
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ABCE1基因上调通过CCL7/受体途径对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭能力的影响及作用机制的初步研究

吴卓  
【摘要】:目的:肺癌是目前世界上发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一。国际癌症研究机构的全球肿瘤流行病统计数据指出肺癌是癌症中诊断率最高的病种,也是全球男性和发达国家女性癌症致死率最高的恶性肿瘤,在发展中国家女性癌症患者死亡率中仅次于乳腺癌。因此我们需要不断探索肺癌发生、发展、侵袭和转移的分子机制,为延长患者生存期和改善生活质量提供新的理论依据和治疗手段。ABCE1即ATP结合盒转运子E1(ATP-binding cassette transporter E1)是ATP结合盒(ABC)超家族的成员之一。其在人的肺癌组织和转移淋巴结中存在高表达,而且与临床分期相关。应用RNAi技术在人小细胞肺癌细胞系NCI-H446中沉默ABCE1基因后,进行体外细胞生物学实验,包括细胞粘附实验、划痕修复实验及迁移与侵袭实验,发现小细胞肺癌细胞在迁移和侵袭的能力上显著下降。通过在裸鼠体内接种ABCE1上调的肺腺癌细胞LTEP-a-2,证实ABCE1是促进肺癌发展和转移的关键因素之一。另外ABCE1在其他多种恶性肿瘤细胞中被发现存在高表达,进一步研究结果表明其与恶性肿瘤的增殖、侵袭和转移存在密切联系。趋化因子(Chemokine)是一类能促使细胞产生趋化运动的小分子分泌型细胞因子,包含大约约70~100个氨基酸,分子量分布于8~14kDa之间,目前研究表明趋化因子与细胞膜表面G蛋偶联受体相互作用,调节了细胞的生长、发育、分化、凋亡等多种生理功能,并且在许多的病理过程中充当重要角色,如炎症反应、细菌病毒感染、创伤修复及肿瘤发生和侵袭等。与此同时趋化因子通过与受体结合,引发下游信号传导,可以促使肿瘤细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),并改变肿瘤微环境,最终导致肿瘤的增殖和转移。实时定量PCR(Real-Time PCR)是目前分子生物学试验中检测基因表达可靠且具有较高灵敏度的方法,其线性范围广,可以检测样本中微量表达的基因,但缺点是每次实验仅仅可以检测少数几个基因的表达水平,如果需要检测大量基因,则工作量庞大而且费时费力。RT~2 Profiler~(TM) PCR Array芯片技术结合了实时定量聚合酶链式反应的优点和芯片的高通量性,具有重复性好、兼顾灵敏度和特异性等优点,性价比高,使用方便,为研究者提供了集中研究特定基因表达的新方法。ABCE1促进肺癌的增殖、侵袭和转移的机制还不明确。本研究希望通过高通量的PCR Array芯片技术在非小细胞肺癌细胞中对ABCE1相关基因进行筛选,找到与ABCE1相关的一个或若干基因,探讨其促进肺癌侵袭和转移的可能机制。研究方法:构建ABCE1过表达慢病毒包装载体LV-GV358-ABCE1,将其感染人H1299肺癌细胞株,进行常规细胞培养。收集细胞并提取mRNA,经反转录反应得到cDNA片段。应用RT~2 Profiler~(TM) PCR Array HumanTumor Metastasis芯片以cDNA为模板进行实时定量PCR反应,筛选出ABCE1相关的肺癌转移相关基因,并从中选出变化差异最明显的基因,以此为研究对象,通过Western Blot验证其蛋白表达与ABCE1的相关性。收集非小细胞肺癌、癌旁组织和转移淋巴结的临床标本,通过免疫组化实验检测所筛选基因和ABCE1蛋白在不同组织中的表达差异,利用Real-Time PCR实验,在mRNA水平检测所筛选基因和ABCE1的表达差异,最后应用统计分析方法对筛选基因和ABCE1进行比较分析,判别两者在肺癌中的的表达相关性。构建筛选基因的过表达慢病毒包装载体,经PCR和基因测序验证后,将其感染人H1299肺癌细胞,并观察感染效率。对成功建立的筛选基因表达上调H1299细胞,利用MTT方法进行细胞增殖能力的检测、Transwell小室进行迁移和侵袭实验以及流式细胞仪对肿瘤细胞进行凋亡检测,目的是观察筛选基因在肺癌细胞中的对细胞增殖、迁移、侵袭等生物学功能的影响。采用Western Blot对筛选基因已知的作用靶点或信号通路相关蛋白进行检测,分析筛选基因在肺癌发生、发展及转移中的作用机制,并探讨ABCE1在肺癌中的可能作用机理。结果:通过PCR Array芯片筛选,我们得到9个与ABCE1有关的肿瘤转移相关基因,其中趋化因子CCL7的变化最显著,在实验中H1299的CCL7mRNA随ABCE1基因的过表达而升高了12倍,从而确定趋化因子CCL7为本研究的主要研究对象。通过Western Blot实验证实CCL7蛋白在ABCE1表达上调的非小细胞肺癌细胞中存在高表达。免疫组化实验显示CCL7和ABCE1蛋白在非小细胞肺癌组织和转移淋巴结中的表达明显高于癌旁组织。Real-Time PCR实验同样表明CCL7和ABCE1的mRNA在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义。结合之前Western Blot实验结果说明CCL7和ABCE1与非小细胞肺癌密切相关,并且CCL7与ABCE1在非小细胞肺癌组织中的表达呈正相关,二者存在相互作用关系。利用慢病毒包装CCL7过表达载体,成功建立CCL7表达上调的H1299细胞株。MTT实验表明,感染LV-CV358-CCL7后的H1299细胞从第3天开始较空载组和对照组细胞数量明显增多,差异具有显著性,说明肺癌细胞内CCL7的表达量增加促进了非小细胞肺癌细胞的增殖。Transwell小室迁移和侵袭实验表明CCL7上调的的H1299细胞具有更强的迁移和侵袭能力,较空载组和对照组有统计学差异。而在流式细胞仪检测凋亡的试验中,感染LV-CV358-CCL7后的H1299细胞与空载组和对照组细胞相比细胞凋亡没有明显变化,统计学分析差异无显著性。通过Western Blot对CCL7及其已知受体和ABCE1进行比较分析,发现感染LV-CV358-CCL7的细胞内随着CCL7蛋白表达的升高,CCR1、CCR2、CCR3的蛋白表达量显著升高,但ABCE1的蛋白表达却无变化。结合文献检索结果,证明在非小细胞肺癌中CCL7与其受体的结合促进了肺癌的增殖和转移。初步判定在ABCE1促进肺癌增殖和转移的机制中,趋化因子CCL7/受体轴是其中之一,ABCE1有可能通过刺激CCL7的产生,使其与受体结合,诱发EMT,并改变肿瘤微环境,最终导致肺癌的增殖和转移。结论:1、在非小细胞肺癌细胞中通过PCR Array芯片成功筛选出ABCE1相关肿瘤转移基因趋化因子CCL7。2、ABCE1和趋化因子CCL7在人非小细胞肺癌组织和转移淋巴结中呈高表达,而在癌旁组织中低表达。趋化因子CCL7与ABCE1在人非小细胞肺癌组织中的表达正相关。3、趋化因子CCL7表达上调能够增强非小细胞肺癌的增殖、迁移和侵袭能力。4、趋化因子CCL7/CCR1、CCR2、CCR3轴是促进非小细胞肺癌增殖和转移的机制之一。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R734.2

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