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《中国医科大学》 2018年
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表面外胚层敲除基因Msx2激活钙信号通路影响小鼠晶状体发育机制的研究

于雯婷  
【摘要】:目的:先天性白内障能导致婴幼儿弱视甚至失明,严重影响婴幼儿及儿童的视力发育,先天性白内障已成为婴幼儿及儿童的第二大致盲原因。先天性白内障除了单独发病还可伴随眼部及其他全身发育异常。目前先天性白内障主要是通过手术治疗。肌节同源盒基因同系物2(Muscle Segment Homeobox,2,Msx2)作为转录调控因子,既往对Msx2基因的研究多集中在其他组织中如牙齿、骨骼、乳腺等组织发育,但近些年有研究发现Msx2基因表达异常可影响晶状体发育导致小眼球畸形。也有研究表明晶状体发育异常会伴随其他眼组织发育异常,这些提示都说明了晶状体在眼发育过程中是至关重要的,而且还会因组织发育诱导过程的异常而导致其他眼组织发育异常。眼部钙信号通路主要参与维持晶状体细胞内环境稳态与影响其发育。钙依赖蛋白酶的升高会伴随晶状体细胞内环境稳态失衡,进而导致细胞内重要的结构蛋白发生不可逆性降解、蛋白与螯合物之间的解聚,非溶解性蛋白会随之升高。所有的这些改变从生理学上来说会导致细胞的凋亡,可影响晶状体的形成与透明。并且有研究表明晶状体细胞内钙稳态的维持主要依靠对钙依赖蛋白酶、钙泵、钙通道的调控,与钙离子的转移与分布密切相关。通过这些调控使晶状体细胞内钙维持正常水平,使晶状体正常的执行其生理功能。目前对Msx2基因通过调控钙信号通路,影响晶状体发育的机制尚未见文献报道。本研究在已知Msx2基因敲除会导致小眼球畸形的基础上,探讨其调控钙信号通路,影响眼发育的机制。研究结果对揭示先天性白内障形成的分子基础,阐明其病理生理学机制具有十分重要的意义。同时,本项研究有着重要的临床医学意义,对先天性白内障的诊断与治疗提供了一定的依据。方法:1、条件敲除小鼠的构建:利用Cre-Loxp技术建立特异性表面外胚层敲除Msx2基因小鼠模型;规定Le-Cre~(+/-)Msx2~(flox/flox)小鼠为基因敲除组即实验组即Msx2-CKO,Msx2~(flox/flox)小鼠为对照组即Msx2-WT,利用PCR技术进行鼠尾裂解确定小鼠胚胎及成鼠基因型。采用PCR技术和免疫荧光技术验证Msx2在晶状体中的表达缺失。2、对实验组和对照组小鼠进行大体对比观察:通过照相对实验组和对照组小鼠进行眼部大体观察比较。复方托吡卡胺滴眼液散瞳后裂隙灯观察小鼠眼前部的差异。之后将小鼠处死,摘取眼球,在解剖显微镜下观察两组小鼠眼的差异,n≥3次。接着,剖开两组小鼠的眼球壁取其相应的晶状体进行差异对比观察,n≥3次。将取出的3组实验组和对照组小鼠晶状体利用精密质量测量仪进行质量分析及统计分析。制备2个月龄实验组和对照组成鼠眼球石蜡切片,通过常规苏木素、伊红染色(HE染色)观察实验组和对照组小鼠眼球及其眼内部细微结构的形态学差异,n≥3次。3、观察Msx2基因条件性敲除小鼠眼球发育的变化:取相应天数的孕鼠,处死后取其胚胎及相应日龄的生后小鼠,利用解剖显微镜对相应天数的实验组和对照组小鼠胚胎及成鼠进行照相,对比两者眼部表型的差异。同理,制备Msx2基因条件敲除小鼠和相应对照组小鼠的胚胎及生后小鼠眼球的石蜡切片,HE染色观察实验组与对照组小鼠眼球发育组织形态学差异,n≥3次。4、BrdU免疫组化检测晶状体细胞增殖:BrdU注射剂量按照100μg/kg的体重用量,腹腔注射BrdU,注射后1小时时处死孕鼠或观察的成鼠,制备Msx2基因条件敲除小鼠和相应对照组小鼠的胚胎及生后小鼠眼球的石蜡切片,利用免疫荧光方法观察Msx2基因条件敲除小鼠及相应天数的对照组小鼠晶状体内BrdU标记细胞比率的变化,n≥3次,并且做统计学分析。5、TUNEL试剂盒检测晶状体细胞凋亡:利用TUNEL凋亡试剂盒标记实验组和对照组小鼠晶状体细胞的凋亡率。,n≥3次,并且做统计学分析。6、小鼠晶状体的RNA-seq高通量测序:摘取生后2个月实验组和对照组小鼠眼球于DEPC-PBS缓冲液中,完整取出晶状体并且剔除周围组织。将其置于RNA-free的EP管中,标记好对应的小鼠基因型Msx2 CKO和Msx2 WT,北京诺禾致源生物技术有限公司进行RNA-seq高通量测序。分析测序结果。7、实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析差异基因的表达:按照操作说明利用Trizol试剂提取实验组和对照组小鼠晶状体的总RNA,并利用微量分光光度计(NanoDrop ND-5000)检测RNA质量和浓度,之后将两组的晶状体mRNA反转录为cDNA。按照TAKARA试剂操作说明利用SYBR方法检测Capn1、Tgm2、Camk2B、Gja8、crystallineαb(Cryab)、crystallineβa1(Cryba1)、crystallineβb1(Crybb1)、crystallineβb3(Crybb3)基因表达,GAPDH作为本实验的内参对照。利用同样的操作方法,经3次独立实验得到的数据利用公式RQ=2-??Ct的方法进行分析。8、免疫荧光:观察Capn1、Tgm2、Camk2B、Gja8在实验组和对照组小鼠晶状体中的表达差异情况。将小鼠胚胎石蜡切片经过脱蜡,复水,抗原修复和封闭后4℃过夜孵育对应抗体,PBS洗片后室温下孵育相应颜色的荧光二抗两小时,PBS洗片,DAPI复染1分钟,PBS洗片,抗淬灭封片剂封片。荧光显微镜下观察、拍照、融合图片。9、免疫组化:观察CRY AB、CRY BA1、CRY BB1、CRY BB3在实验组和对照组小鼠晶状体的表达差异情况。将小鼠胚胎石蜡切片,脱蜡,复水,抗原修复和封闭后4℃过夜孵育对应抗体,PBS洗片后室温下孵育二抗两小时,PBS洗片,DAB染色,PBS洗片,脱水后苏木素复染5分钟,复水,二甲苯,树脂封片,显微镜下观察、拍照。10、质粒制备:本实验中选择小鼠晶状体上皮细胞(α-TN4)细胞作为转染载体,pegfp-c1作为空载体。利用Vector NTI进行单克隆酶切位点分析,将SalⅠ和BamHⅠ作为本实验合适的单克隆酶切位点,人工合成804bp Msx2片段并且两段加上同样的酶切位点。然后,将空载体和片段进行双酶切后,得到互补的粘性末端。这时,开始链接反应。经过转化,摇菌,涂板,挑取单克隆,菌液PCR,送测序,质粒大提后进行相应的细胞转染。11、细胞转染:待细胞密度到70%-80%时开始转染,将DMEM-/-与将实验组、对照组的质粒按照3:1进行混合,同时将DMEM-/-与lipofectamin 2000进行同比例混合。质粒需要一滴滴加进转染试剂中,让其表面附带电荷。两者室温下孵育5min后再将两混合物进行混合,室温孵育15-20min后加入细胞中进行培养。因该转染试剂毒性较强,转染6小时后更换新鲜培养液并于24小时后观察转染结果并且提取蛋白质和相应RNA。12、Western Blot:弃细胞培养液后用PBS洗细胞3次,再将蛋白裂解液均匀的滴加在细胞上,刮下细胞后离心冰上静置,收集裂解液,再次离心,吸取上清,蛋白定量。蛋白定量后跑浓缩胶与分离胶,转膜,裁膜,封闭,孵育对应Capn1、Tgm2、Camk2B、Gja8一抗4℃过夜,TBST洗膜,二抗室温下2小时,洗膜后滴加显影液进行显影,拍照。13、透射电镜:取2个月实验组与对照组小鼠,从小鼠处死眼球离体至取出晶状体全过程均在固定液中进行。将取出的晶状体放在存有固定液的1.5ml EP管中并将组织完全浸没。然后将组织送到中国医科大学生物细胞教研室电镜室进行洗涤、梯度乙醇脱水和树脂包埋,再将样品切成超薄片并复染。使用HITAC IH-7650电子显微镜成像及观察拍照。14、统计学分析:应用GraphPad统计分析软件进行统计学分析。数据以均值±标准差表示,采用独立样本t检验(independent samples T-test)进行分析。P0.05为有统计学意义。结果:1、本实验使用Pax6启动子驱动的Cre重组酶,将Msx2基因在小鼠胚胎早期于表面外胚层剔除。该方法使用了Cre-LoxP实验技术进行条件性基因敲除。并通过鼠尾裂解、PCR鉴定其基因型。免疫荧光结果显示Msx2基因在Msx2 CKO实验组小鼠的晶状体上表达缺失。2、与对照组成鼠表型相比实验组成鼠眼周围有线性毛发缺损,眼睑及睑裂减小,睫毛排列不规则并且有一部分缺少。裂隙灯下观察实验组小鼠眼球小、瞳孔不能散大,虹膜与角膜相贴,晶状体体积减小,内部呈现不同程度混浊。HE染色结果显示,整个眼球体积相比对照组减小。正常房角结构消失,实验组小鼠晶状体体积减小且形状不规则、不圆且内部呈现不均匀混浊。实验组晶状体重量明显小于对照组组小鼠晶状体,并且差异具有统计学意义。3、实验组小鼠从观察期胚胎12.5天开始到小鼠生后8天,与对照组相比Msx2条件敲除小鼠出现不同程度的小眼球畸形伴随先天性白内障以及眼前节发育异常,表现为晶状体体积明显小于对照组,晶状体细胞排列紊乱、排列不规则。实验组小鼠的晶状体前、后径均小于对照组小鼠,并且实验组小鼠角膜厚度薄于对应天数的对照组小鼠。4、TUNEL凋亡检测结果显示,自胚胎12.5天开始,Msx2基因条件性敲除小鼠晶状体细胞凋亡率不同程度的高于对照组,并且差异有统计学意义。相反,BrdU~+标记免疫荧光结果显示,自胚胎12.5天开始对照组晶状体细胞增殖数明显高于实验组,并且两者差异呈现逐渐缩小的趋势,两组的差异具有统计学意义。5、取2个月同窝出生的实验组和对照组小鼠晶状体组织做RNA-seq测序分析研究。测序结果显示找到显著表达差异基因(differentially expressed genes,DEGs)1911个,其中上调基因1586个,下调基因325个。富集分析得出结果如下:(1)GO(Gene Ontology,GO)富集分析包括生物学过程(biological processes,BP)、细胞组分(cellular components,CC)和分子功能(molecular function,MF)3种结构化网络。在BP中发现眼发育异常排在第5位,在CC中发现复杂离子通道排位第1,在MF中发现活化离子通道排位第2、钙离子结合排位第14、晶状体结构组分排位第17。(2)KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析中与眼发育密切相关的为钙信号通路,排位第4,并且作为本实验的研究重点。(3)Reactome富集分析中显示视觉光传导排位第8。6、本实验通过RNA-seq测序分析发现Msx2基因通过钙信号通路影响眼发育,采用Real-Time PCR在RNA水平上验证基因的表达差异。实验组小鼠晶状体相对于对照组小鼠晶状体中Gja8表达下调,Capn1、Tgm2、Camk2B表达上调。相对于对照组,实验组小鼠晶状体中的crystallineαb、crystallineβa1、crystallineβb1和crystallineβb3表达均下调,这些基因在两组小鼠中表达差异均具有统计学意义。7、培养鼠晶状体上皮细胞(α-TN4),将构建好的pEGFP-C1和pEGFP-C1-Msx2质粒转染至细胞内,转染成功后提取蛋白,进行Western Blot分析。得出与转染pEGFP-C1-Msx2质粒的鼠晶状体上皮细胞提取蛋白质相比,Gja8在转染pEGFP-C1质粒细胞中表达下调,Capn1、Tgm2、Camk2B在转染pEGFP-C1质粒细胞中表达上调。8、免疫荧光结果显示,胚胎14.5天时与对照组小鼠晶状体的表达相比,Gja8在实验组小鼠晶状体中表达下调,Capn1、Tgm2、Camk2B在实验组小鼠晶状体中表达上调。9、免疫组化结果显示,胚胎14.5天CRYAB、CRYBA1、CRYBB1、CRYBB3在实验组小鼠晶状体中表达均下调。10、透射电镜显示,与实验组相比对照组小鼠晶状体细胞之间缝隙连接不均匀并且变宽,缝隙连接之间有脂肪沉积,细胞间的缝隙连接结构破坏。实验组晶状体细胞形状不规则,排列紊乱,并且有大范围融合的改变。相比之下,对照组小鼠晶状体细胞形态正常、排列规则,晶状体细胞之间连接正常。11、晶状体RNA-seq测序结果显示,可变剪接(Alternative splicing,AS)包括内含子保留(retained intron,RI),可变的5’端(alternative 5’splice site,A5SS)可变的3’端(alternative 3’splice site,A3SS),跳跃外显子(Skipped exon,SE),互斥外显子(mutually exclusive exons,MXE)。其中Capn1发生了A3SS,Camk2B发生了RI,Cryba1发生了11种SE,1种A3SS和5种MXE,Crybb1发生了2种A5SS。RNA-seq结果还显示,Capn1,Camk2B,UPS,Gja3,Cryaa,Cryab,Cryba1,Cryba4,Crybb1,Crybb2,Crybb3,BF-SP2生物学类型发生了改变。结论:1、利用Cre-Loxp系统进行条件性基因打靶,可以使Msx2基因于小鼠胚胎早期在表面外胚层条件性敲除,而其他组织中Msx2表达不受影响。2、Msx2基因于表面外胚层条件性敲除后,小鼠模型眼表型为小眼球畸形伴有先天性白内障及眼前节发育障碍。3、Msx2基因表面外胚层条件性敲除后晶状体细胞实验组相比对照组凋亡增加而增殖减少。4、RNA-seq分析得出表面外胚层敲除Msx2基因后先天性白内障形成与钙信号通路密切相关。5、表面外胚层Msx2基因条件性敲除后,钙信号通路中的Gja8、Capn1、Tgm2和Camk2B表达改变,以及下游的晶状体蛋白CRYAB、CRYBA1、CRYBB1、CRYBB3和晶状体特异性蛋白表达均有改变。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R776.1

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