收藏本站
《中国医科大学》 2019年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

LncRNA-Gas5/miRNA21 ceRNA调控网络在糖尿病肾病发病机制中的作用研究

王二敏  
【摘要】:目的:糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。糖尿病时长期存在的高血糖,导致各种组织,特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。糖尿病的并发症包括大血管和微血管病变,而最常见的微血管并发症之一就是糖尿病肾病(diabetic kidney disease,DKD),在糖尿病患者中,大约三分之一的患者最终出现蛋白尿,逐渐出现肾功能异常,成为导致终末期肾脏病(end-stage renal disease,ESRD)的主要因素。最近的流行病学研究表明,自2011年以来,在三甲医院住院患者中糖尿病相关慢性肾脏病的比例已超过慢性肾小球肾炎相关的慢性肾脏病。目前糖尿病肾病的确切发病机制不十分明确,蛋白激酶C、多元醇通路及非酶糖基化产物受血糖及其代谢产物的激活,共同损伤肾脏的结构和功能。在临床及动物实验中,尿微量白蛋白的出现作为糖尿病出现肾脏损害时诊断的唯一标准,同时尿微量白蛋白也是作为监测DKD进展严重程度监测指标。然而,目前研究发现,给没有出现尿微量白蛋白的患者做肾活检,部分病人已经出现了弥漫性肾小球纤维化,间质纤维化和肾小管萎缩,故单一用尿微量白蛋白作为诊断和监测DKD的唯一指标已不能满足DKD早期诊断的需求。近期研究发现,非编码RNA及遗传易感性等也参与DKD发病过程。肾小球中系膜细胞外基质(extracellular matrix,ECM)堆积是糖尿病肾脏受累的特征性病理改变,然而DNA的甲基化,lncRNA和miRNA都会影响ECM的堆积,导致糖尿病肾病的发生、发展。研究证实,在肾小球系膜细胞中lncRNA-PVT1和TGF-β1的表达是上调的。在高糖和TGF-β1的作用下,来自PVT1的miR-1207-5p的表达在肾细胞中显著增加,但是TGFβ1独立于PVT1。这些证据提示lncRNAmiRNA相互作用在DKD的发生发展中起到了关键的作用。竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)ceRNA是指一个miRNA可以调节多个靶基因,同一个靶基因可以被不同的miRNA调节,而被同一miRNA调控的RNA之间就构成了一种竞争关系,称之为ceRNA。以miRNA为中心,可以和同一miRNA结合的靶基因,如果它们具有相同的miRNA应答元件(miRNA response element,MRE),彼此之间可以形成相互竞争的关系。能和miRNA结合的RNA包括编码蛋白的mRNA、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和一些假基因转录物等,如果细胞内这些RNA的表达水平增加,与mRNA竞争miRNA的结合位点,这可能导致其他RNA的蛋白质表达水平增加。从而影响细胞的功能。目前,对ceRNA的研究主要集中在肿瘤的方向,调控肿瘤的发生发展。真核生物中90%的基因组被转录,但98%转录成无蛋白编码功能的非编码RNA,以前认为这些非编码RNA没有功能,目前研究发现,它们在基因的转录、转录后水平发挥重要作用。在DKD发病机制的研究中,miRNA的研究较多,而LncRNA与DKD关系的研究比较少,ceRNA的提出,为DKD发病机制的研究开阔了新的视野,有望找到新的标志物或治疗靶点。(一)微小RNA(miRNA)近年来,短链非编码RNA的出现为DKD标记提供了新的方向。miRNA通过补充命令的方式,作用于其靶信使RNA(mRNA)的3'非翻译区,导致转录后基因不编码蛋白,从而达到基因沉默的效果。目前体内及体外研究都认识到miRNA表达异常和DKD发生发展的病理过程相关。miRNA-21通过PTEN-SMAD7作用于肾脏,且miRNA-21上调程度与肾脏纤维化和肾功能下降率成正相关。此外,近期研究发现血清和肾组织中miRNA-21表达和DKD进展程度相一致。在STZ诱导的DKD小鼠中,抑制miRNA-21表达后,发现足细胞损伤减轻、尿白蛋白减少,以及纤维化和炎症基因表达降低。在本研究小组之前的研究中,我们发现高葡萄糖诱导系膜细胞中miRNA-21的表达上调,而其下游靶蛋白PTEN的表达降低。从而激活Akt/mTOR信号通路,导致系膜细胞自噬抑制,促进肾小球系膜细胞的肥大,并导致细胞外基质蛋白的积累,从而改善高葡萄糖诱导的系膜细胞肥大、自噬增强,细胞外基质蛋白的堆积减少。此外,研究小组还发现,糖尿病肾病患者血清miR-21表达水平与尿微量白蛋白水平呈正相关,与肾功能下降和血清白蛋白下降水平亦呈正相关。以上的相关分析提示糖尿病状态下miR-21过表达可能促进了糖尿病肾病的病理严重程度进展并促进了病理分级,促进尿液中蛋白质增加,血清白蛋白下降,肾功能下降。(二)长链非编码RNA(LncRNA)LncRNA是一组不具有编码蛋白质能力的功能性长链RNA,长度超过200nt。最近,相关研究报告指出LncRNA的调节异常与与许多疾病有关,包括糖尿病肾病。因此,LncRNA参与DKD发病机制的研究,有望成为新的治疗靶点、基因调节者或者预后标志物。近期研究发现,在糖尿病大鼠视网膜细胞和高糖培养的内皮细胞中LncRNA MALAT1的表达上调,说明LncRNA MALAT1参与DM微血管病变的发生发展。Zhang等发现在乳腺癌患者的研究中,癌组织的miR-21高于癌旁组织。此外,可以降低LncRNA GAS5,并且干扰GAS5可以增加miR-21的表达。miR-21不仅对肿瘤蛋白编码基因具有靶向抑制作用,而且还抑制LncRNA GAS5。相关研究显示乳腺癌患者中miR-21和Gas5表达之间呈负相关。LncRNA-GSA5是miR-21的负调节因子,调节软骨细胞存活并参与骨关节炎的发展。本研究的前期实验表明,糖尿病组和糖尿病肾病组中血清lncRNA GAS5的表达显著低于正常组。经过相关分析发现,血清中lncRNA GAS5与空腹血糖和糖化血红蛋白呈负相关。提示血清lncRNA GAS5的下调有可能促进了血糖的升高。总之,先前的实验证实了糖尿病肾病患者血清中miR-21的表达,GSA5表达下调,本研究将从LncRNA-GSA5/miR-21 ceRNA为切入点,在动物和细胞实验中,探讨了ceRNA在糖尿病肾病中发展的可能机制。研究方法:以8周龄db/db、db/m小鼠为研究对象,20周后取肾脏组织,用RT-PCR法测定肾脏组织中LncRNA-GSA5、miR-21的含量;western blot测定肾脏组织中CCND1、CDK4、FN、IV胶原蛋白、PTEN的表达。以大鼠系膜细胞为研究对象,分为正常糖组(葡萄糖5.5mmol/L)、高渗对照组(19.5mmol/L甘露醇+5.5mmol/L葡萄糖)、高糖组(葡萄糖25mmol/L),分为24、48、72小时的不同时点,应用MTT法测定高糖诱导下系膜细胞的增值率;应用RT-PCR法测定高糖诱导下系膜细胞LncRNA-GSA5、miR-21的含量;western blot测定高糖诱导下系膜细胞中CCND1、CDK4、FN、IV胶原蛋白、PTEN的表达;用流式细胞技术检测高糖诱导下系膜细胞周期的变化;并进一步转染miR-21抑制质粒及LncRNA-GSA5过表达质粒,免疫荧光测定转染率,应用RT-PCR法测定高糖诱导下系膜细胞分别转染miR-21抑制质粒及LncRNA-GSA5过表达质粒后LncRNA-GSA5、miR-21的含量;western blot测定高糖诱导下系膜细胞分别转染miR-21抑制质粒及GSA5过表达质粒后CCND1、CDK4、FN、IV胶原的表达;用流式细胞技术检测高糖诱导下系膜细胞周期的变化;结果:1、db/db 2型糖尿病小鼠对肾脏组织的影响:肾脏组织体积增大、重量增加、血糖、尿微量白蛋白、血肌酐升高;2、RT-PCR法检测db/db组与db/m RNA表达的变化:miR-21表达较对照组明显增加(P〈0.01),LncRNA-GSA5表达较对照组减少(P0.05),PTEN表达较对照组明显降低(P〈0.01);3、western blot法检测糖尿病肾病组与正常组纤维化程度的结果显示:FN、IV胶原表达较对照组明显增加(P〈0.01);4、western blot法检测糖尿病肾病组组与正常组细胞周期蛋白变化的结果显示:CCND1、CDK4表达较对照组明显增加(P〈0.05);5、MTT法测定增值率的结果显示:高糖培养24小时后,高糖组较对照组细胞增殖无明显变化。但从48、72小时的细胞增值率明显增加,以48小时增值最为显著(P〈0.01);6、RT-PCR法检测高糖诱导下系膜细胞培养48小时后RNA表达的变化:miR-21表达较对照组明显增加(P〈0.01),LncRNA-GSA5表达较对照组减少(P0.05),PTEN表达较对照组明显减少(P〈0.01);7、western blot法检测高糖诱导下系膜细胞培养48小时后细胞纤维化的结果显示:FN、IV胶原表达较对照组明显增加(P〈0.05);8、western blot法检测高糖诱导下系膜细胞培养48小时后周期蛋白变化的结果显示:CCND1、CDK4表达较对照组明显增加(P〈0.05);9、流式细胞技术测定细胞周期结果显示:系膜细胞停滞在G0/G1期。10、转染miR-21抑制质粒48小时后:细胞增值率明显下降(P〈0.05),LncRNA-GSA5表达较对照组增加(P0.05),PTEN表达较对照组明显增加(P〈0.05),FN、IV胶原表达较为对照组明显减少(P〈0.05),CCND1、CDK4表达较对照组明显减少(P〈0.05);细胞停滞G0/G1期,G1/S阻滞;11、转染LncRNA-GSA5过表达质粒48小时后:细胞增值率明显下降(P〈0.05),miR-21表达较对照组减少(P0.05),PTEN表达较对照组明显增加(P〈0.05),FN、IV胶原表达较为对照组明显减少(P〈0.05),CCND1、CDK4表达较对照组明显减少(P〈0.05);细胞停滞G0/G1期,G1/S阻滞。结论:(1)糖尿病状态下肾小球系膜细胞内miR-21的过表达和LncRNA-GSA5低表达,靶向抑制PTEN导致系膜系膜细胞肥大、细胞周期缩短和增殖,导致细胞外基质蛋白堆累。(2)转染miR-21 inhibitor的高糖组培养的系膜细胞内PTEN表达明显上调,LncRNA-GSA5表达上调,系膜细胞周期停滞并且增殖能力降低,从而减轻糖尿病肾脏损害。(3)转染LncRNA-GSA5过表达质粒的高糖组培养的系膜细胞内,miR-21表达下调,系膜细胞细胞周期停滞,增殖能力下降,减少细胞外基质蛋白的堆积,改善糖尿病肾脏损害。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R587.2;R692.9

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 黄锋先,唐盛,杨琼琼,陈黎红,刘伟,余学清;2型糖尿病合并肾脏损害的病理与临床分析[J];中华肾脏病杂志;2005年11期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 石婉容;;对2型糖尿病合并肾病患者的临床治疗研究[J];心血管病防治知识(学术版);2015年02期
2 高妍婷;李振江;王晓明;孙燕;梁衍;荀利如;冯婷;金刚;;血管紧张素转换酶基因多态性与2型糖尿病肾脏疾病的相关性研究[J];陕西医学杂志;2014年10期
3 张爱平;侯宜凯;王艳侠;石书梅;丁尧海;郭云珊;张磊;李震;张峥梅;;81例2型糖尿病合并非糖尿病性肾脏疾病患者肾脏临床与病理分析[J];中华全科医师杂志;2013年11期
4 孙冰;;38例2型糖尿病合并肾病的临床治疗分析[J];中国医药指南;2013年25期
5 王永丽;杨秀勇;;2型糖尿病合并肾脏损害临床病理特点分析[J];内蒙古中医药;2013年15期
6 何一飞;;厄贝沙坦联合阿魏酸钠治疗早期糖尿病肾病78例[J];中西医结合心脑血管病杂志;2012年04期
7 王立新;;老年2型糖尿病肾脏损害的临床与病理分析[J];中国社区医师(医学专业);2012年07期
8 陶涛;刘璠娜;尹良红;;终末期糖尿病肾病治疗的研究进展[J];广东医学;2011年24期
9 任雯雯;李文歌;邹古明;方静;芦建华;曹娅丽;卓莉;邹万忠;;202例糖尿病患者并发非糖尿病性肾损害的临床病理[J];中华肾脏病杂志;2011年10期
10 陈浩;王晋文;殷玉敏;;2型糖尿病合并肾脏损害47例临床病理分析[J];糖尿病天地(临床);2011年03期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 张波 ,刘志红 ,曾彩虹 ,陈惠萍 ,周虹 ,黎磊石;糖尿病肾病合并非糖尿病肾脏病变的临床病理分析[J];中华老年多器官疾病杂志;2002年03期
2 刘刚,王梅,刘玉春,邹万忠,王海燕;2型糖尿病患者合并非糖尿病性肾损害的临床病理分析[J];中华肾脏病杂志;2001年04期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 热孜万古力·阿帕尔;吴红;;2型糖尿病肾病患者检测血清基质金属蛋白酶-10的意义[J];现代检验医学杂志;2016年03期
2 赵日新;陈瑞;谢佳欣;战翔宇;耿浩文;隋洪玉;;浅议糖尿病肾病发病机制及防治方法[J];广东化工;2019年19期
3 王聪;王晓琴;;羟苯磺酸钙联合奥美沙坦对老年2型糖尿病肾病的蛋白尿影响研究[J];心理月刊;2019年22期
4 沈冬琴;;中西医结合治疗糖尿病肾病Ⅲ期气虚血瘀证72例临床效果分析[J];临床医药文献电子杂志;2019年79期
5 王超;;高频超声评价肾小球滤过率对2型糖尿病肾病患者颈动脉内-中膜厚度及颈动脉粥样硬化血管重构的影响[J];中国医疗器械信息;2019年21期
6 王小星;;糖通饮联合羟苯磺酸钙治疗2型糖尿病肾病早期疗效观察[J];中国社区医师;2019年32期
7 胡晓蓉;;糖尿病病人常见的饮食、运动误区[J];中国水电医学;2006年06期
8 赵玉馨;;糖尿病肾病61例临床分析[J];水电医学杂志;1995年01期
9 郑洁;;糖尿病肾病易患因素分析[J];中国水电医学;2003年02期
10 崔兆山;陈长法;李瑞金;;对比分析血液透析、腹膜透析对终末期糖尿病肾病的临床治疗价值[J];人人健康;2019年22期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 姜嫄嫄;;糖尿病肾病中医药诊治进展[A];中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会2018年学术年会论文摘要汇编[C];2018年
2 郑鹏飞;赵宗江;;中西医结合治疗糖尿病肾病的研究进展[A];中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会2018年学术年会论文摘要汇编[C];2018年
3 张萌萌;赵宗江;;糖尿病肾病的护理研究进展[A];中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会2018年学术年会论文摘要汇编[C];2018年
4 柯志飞;黎妮;;运动与糖尿病肾病[A];2016年中国生理学会运动生理学专业委员会会议暨“运动生理学(实验)教学改革”教学研讨会论文摘要汇编[C];2016年
5 刘建英;;他汀类药物与糖尿病肾病[A];江西省中西医结合学会内分泌专业委员会第四次学术交流会暨内分泌疾病中西医结合诊疗进展学习班资料汇编[C];2018年
6 向长玉;;活血化瘀药治疗糖尿病肾病作用机制的探讨[A];中华中医药学会糖尿病分会全国中医药糖尿病大会(第十九次)资料汇编[C];2018年
7 马素起;;中西医结合干预糖尿病肾病文献综述[A];中华中医药学会糖尿病分会2019首届全国中青年中医糖尿病论坛论文集[C];2019年
8 李建婷;侯鲁鲁;刘洋;逄曙光;;白介素31水平与糖尿病肾病发病相关性研究[A];中华中医药学会糖尿病分会全国中医药糖尿病大会(第十九次)资料汇编[C];2018年
9 李学文;李爱云;李雪英;;糖尿病肾病研究进展[A];中华中医药学会糖尿病分会全国中医药糖尿病大会(第十九次)资料汇编[C];2018年
10 李楠;黄莉吉;王丽娟;余江毅;;基于“湿热蕴络,气化失常”对黄蜀葵花治疗糖尿病肾病的机制探讨[A];第十二次全国中西医结合内分泌代谢病学术大会暨糖尿病、甲状腺疾病高峰论坛论文资料汇编[C];2019年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 陈敏 通讯员 庞赟;糖尿病防治:管住嘴迈开腿[N];宁波日报;2018年
2 嘉定区中医医院肾病科内病一组 水光兴;糖尿病肾病莫心慌,中医中药来帮忙[N];上海中医药报;2019年
3 本报记者 梁莹;关注糖尿病,每一个家庭都需要[N];广西日报;2019年
4 本报记者 王潇雨;糖尿病肾病 哪些科研进展须关注[N];健康报;2019年
5 本报记者 喻京英;防控糖尿病 保护全家人[N];人民日报海外版;2019年
6 本报记者 程守勤 通讯员 罗鑫;糖尿病分级诊疗的“栖霞模式”[N];健康报;2017年
7 本报记者 姬薇;糖尿病患者教育,谁付费?[N];工人日报;2018年
8 北京中医药大学东直门医院大内科副主任 内分泌重点学科带头人 赵进喜;糖尿病辨治:分清体质降血糖[N];健康报;2016年
9 健康时报记者 刘玫妍;美国人看什么病花钱最多?[N];健康时报;2017年
10 记者 张磊;糖尿病患者吃水果有好处[N];健康报;2017年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 路萍;ILC2s与终末期糖尿病肾病患者“代谢综合征”状态的关系研究[D];江苏大学;2018年
2 陈梁凯;晚期糖基化终末产物及其受体与2型糖尿病的关联性研究[D];华中科技大学;2019年
3 章晓燕;糖尿病周围神经血管病变的血清标志物研究[D];上海交通大学;2016年
4 王二敏;LncRNA-Gas5/miRNA21 ceRNA调控网络在糖尿病肾病发病机制中的作用研究[D];中国医科大学;2019年
5 王涛;遗传因素对体脂分布及糖尿病的关联研究[D];上海交通大学;2018年
6 马超;基于Sirt1/NF-κB通路介导的炎症机制和脂代谢紊乱探究早期糖尿病肾病“气阴两虚、络脉瘀阻”病机的物质基础[D];浙江中医药大学;2016年
7 王宏献;早期糖尿病肾病中医证候与尿液蛋白质组学的关系研究[D];浙江中医药大学;2013年
8 童楠;益肾颗粒调控足细胞自噬改善糖尿病肾病的作用机制研究[D];中国中医科学院;2018年
9 王晚霞;糖尿病肾病RNA氧化损伤的评估及机制分析[D];北京协和医学院;2015年
10 贺小宁;基于医保数据的2型糖尿病与癌症发生风险研究[D];天津大学;2017年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王看然;ACEi或ARB对糖尿病合并蛋白尿患者全因死亡率和肾脏结局的影响:系统回顾和meta分析[D];重庆医科大学;2019年
2 张攀扬;LncRNA Rpph1结合Galectin-3介导MEK/ERK信号通路调控糖尿病肾病炎症与增殖的分子机制研究[D];重庆医科大学;2019年
3 冉茜;住院2型糖尿病肾病患者中早发糖尿病与动脉粥样硬化的关系研究[D];重庆医科大学;2019年
4 桑祎莹;2003-2017年中国城市和农村20-79岁人群糖尿病死亡趋势及其年龄-时期-队列的研究[D];重庆医科大学;2019年
5 武少玮;湿热型糖尿病辨治的数学模型构建与体系研究[D];山东中医药大学;2017年
6 李冬梅;2型糖尿病患者血清25-羟维生素D水平与周围神经病变的相关性研究[D];河北医科大学;2019年
7 张万静;2型糖尿病患者血脂水平与糖尿病肾病的相关性研究[D];河北医科大学;2019年
8 贾娟;2型糖尿病伴高尿酸血症的相关因素分析[D];河北医科大学;2019年
9 吴雅楠;糖尿病肾脏疾病患者血清FGF23水平的变化及相关性研究[D];蚌埠医学院;2019年
10 郝芳晨;血脂、尿酸与2型糖尿病患者视网膜病变的关联研究[D];蚌埠医学院;2019年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026