收藏本站
《中国医科大学》 2019年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

ROS1基因对胃癌细胞生物学行为的影响及其分子机制的研究

乔京京  
【摘要】:目的:在全世界范围内,胃癌发病率占恶性肿瘤总发病率的第4位,而死亡率却排在第3位的常见的恶性肿瘤之一。我国是胃癌大国,东南沿海地区是胃癌的高发地区。所以胃癌是严重影响我国国民健康的重大疾病。由于缺乏特异性症状,临床上很难早期发现,临床Ⅲ期、Ⅳ期患者占大多数。目前胃癌内科治疗手段有限,能进行根治性手术的患者比例小,化疗疗效欠佳,靶向治疗也只有曲妥珠单抗和阿帕替尼取得了肯定的临床疗效,但适用人群有限,还存在着治疗耐药问题。当今肿瘤治疗已进入精准医疗时代,需要找到新的治疗靶点,开发新的治疗药物。ROS1是一种是单体型受体酪氨酸激酶,广泛表达于人体肾、小脑、胃肠等多种组织。目前的研究发现在肺癌、卵巢癌、肉瘤、胆管细胞癌和炎性肌纤维母细胞瘤等组织中以基因重排方式激活,是一种癌基因。近年在非小细胞肺癌的临床研究中找到了针对ROS1基因重排的治疗药物克唑替尼。使这一基因成为恶性肿瘤精准治疗研究的重要靶点。已有国内外学者在胃癌临床组织标本中用FISH方法检测到ROS1基因重排,且确定ROS1基因重排与差的临床表型如低分化、淋巴结转移相关。因此虽然ROS1基因重排在胃癌中检出率不高,但已经开发出确定有效的靶向治疗药物,对ROS1在胃癌中的作用机制仍有必要进一步研究。ROS1基因以基因重排的融合基因方式出现,既往的研究主要集中在ROS1融合基因结构和检测方法及融合基因功能的研究方面,然而各融合基因功能并不完全相同。本研究仅以ROS1基因为研究对象,忽略其融合伙伴,并以胃癌细胞为研究对象,探讨ROS1基因本身对胃癌细胞生物学行为的影响和作用机制。为进一步研究以该基因为靶点的治疗提供基础研究数据。研究方法:首先,应用Western blot方法评估四种人胃癌细胞系BGC-823、MGC-803、SGC-7901、HGC-27癌细胞中ROS1蛋白表达量,选取其中表达量最高的两个细胞系为研究对象。构建ROS1基因干扰RNA质粒及无关序列质粒,其基因片段分别为ROS1 sh RNA:5'-GAGGAGACCTTCTTACTTAT-3';NCsh RNA:5'-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。经测序鉴定证实质粒构建成功。用构建成功的两种质粒分别转染两种选定的胃癌细胞系,培养24小时后应用含G418的培养基进行筛选培养。2周后得到稳定转染目的基因的胃癌细胞株。分别应用Real-time PCR方法和Western blot方法从mRNA水平和蛋白水平两个方面进行鉴定,明确基因敲减率,敲减率在70%以上时进行后续实验。第二步,应用MTT法测定胃癌细胞生长曲线,克隆形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡,明确ROS1基因敲减后胃癌细胞生长、增殖及凋亡能力的变化;用划痕愈合实验及Transwell小室实验检测胃癌细胞迁移和侵袭能力,明确ROS1基因敲减后胃癌细胞侵袭转移能力的变化。第三步,应用Western blot方法检测凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3,cleaved PARP,Bax,bcl-2蛋白表达情况,了解ROS1基因抑制细胞凋亡途径。Western blot方法检测细胞粘附蛋白E-cadherin,N-cadherin及细胞骨架相关蛋白Vimentin表达情况,明确ROS1基因是否参与胃癌细胞EMT过程。Western blot方法检测信号传导通路蛋白p-PI3K/PI3K,p-AKT/AKT蛋白表达情况,明确ROS1基因细胞内信号传导路径。Real-time PCR方法检测上皮间质转化相关基因Snail,Slug,Twist表达情况及MMP9基因表达情况,明确ROS1基因是否通过诱导肿瘤细胞形成EMT促进胃癌细胞侵袭转移。第四步,应用TCGA数据库分析ROS1在胃癌组织中的表达与临床病理因素的关系及其对预后的影响及ROS1基因扩增的情况。qRT-PCR检测ROS1在37例胃癌组织及配对正常胃粘膜中的表达,应用免疫组化方法检测126例胃癌组织切片中ROS1表达情况。结果:1、Western blot方法检测显示BGC-823细胞和SGC-7901细胞ROS1蛋白相对表达量较高,被选为进一步研究对象。转染含ROS1干扰RNA质粒和无关序列质粒之后,得到稳定转染两个目的基因的胃癌细胞株并成功体外传代培养。经Real-time PCR方法和Western blot方法从mRNA表达和蛋白表达两个方面进行鉴定,确认两个稳转胃癌细胞株ROS1基因敲减率均达75%以上,证实ROS1基因稳定敲减的胃癌细胞株构建成功。2、MTT实验发现ROS1基因敲减后的BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1分别较各自对照组细胞生长速度减慢,生长率较BGC-823细胞及SGC-7901细胞分别下降了37%和30%(P0.01)。克隆形成实验显示BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞分别较各自的对照组细胞克隆形成数明显减少,克隆形成率分别为19.5%±1.8%vs 37.33%±2.25%、36.17%±1.76%及16.00%±2.00%vs 33.50%±1.50%、31.17%±2.52%(P0.01)。流式细胞仪检测细胞周期实验显示与BGC-823细胞和SGC-7901细胞比较,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-shROS1细胞G0/G1期细胞比例增高(55.77%±2.70%vs 61.08%±0.87%;55.33%±0.88%vs 67.43%±0.65%),而S期(20.73%±1.83%vs 12.96%±0.20%;18.98%±074%vs 15.78%±0.27%)和G2期(23.25%±0.61%;24.55%±3.15%vs13.98±0.59)细胞比例明显减少,均有统计学差异(P0.01)。流式细胞仪检测凋亡发现与BGC-823细胞和SGC-7901细胞比较,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞早期凋亡(2.99%±0.11%vs 15.94%±0.85%;5.78%±0.42%vs16.19%±1.01%)与晚期凋亡(0.42%±0.03%vs 0.42%±0.03%;1.18%±0.09%vs9.13±0.62%)比例明显增高(P0.01)。Transwell侵袭实验结果显示与BGC-823细胞和SGC-7901细胞比较,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞穿过微孔膜由上室进入下室的细胞数明显减少(21.4±2.07 vs 43.2±4.15;20.60±2.30 vs61.4±5.18),差异显著(P0.01)。3、进一步应用Western blot方法检测凋亡相关蛋白,发现与BGC-823细胞和SGC-7901细胞比较,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞cleaved-caspase-3,cleaved PARP蛋白相对表达量明显上升,分别为:3.71±0.27,1.58±0.04及1.49±0.03,1.91±0.08;Bax蛋白相对表达量(1.43±0.13,1.52±0.07)明显上升,bcl-2蛋白相对表达量(0.50±0.02,0.34±0.02)明显下降,P值均0.01。而细胞粘附蛋白和骨架相关蛋白的检测结果显示,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞E-cadherin表达量明显增加(2.14±0.13,2.52±0.04),N-cadherin蛋白(0.48±0.04,0.38±0.02)和Vimentin蛋白(0.52±0.04,0.49±0.07)的相对表达量则明显减少,P值均0.01。在信号传导通路蛋白方面,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞总PI3K蛋白和总AKT蛋白表达量与BGC-823细胞和SGC-7901细胞无统计学差异(P0.05);但磷酸化的p-PI3K(0.33±0.04,0.42±0.02)和p-AKT蛋白(0.51±0.01,0.54±0.01)相对表达量明显下降,有统计学差异(P0.01)。(以上结果均分别以BGC-823细胞和SGC-7901细胞的相应蛋白表达量为“1”计算)。4、用Real-time PCR方法检测胃癌细胞诱导EMT相关基因的结果显示,BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞中Twist,Snail,Slug三个基因表达均较BGC-823细胞和SGC-7901细胞明显下降,但不同细胞下降程度不一样。BGC-823-sh ROS1细胞中三个基因相对表达量值分别为:Twist(1.59vs2.36),Snail(0.43 vs 0.76),Slug(1.40vs2.06)。SGC-7901-sh ROS1细胞中三个基因相对表达量值分别为:Twist(0.84vs1.00),Snail(0.84vs1.00),Slug(0.57vs1.00)。以上结果均有统计学差异,P0.01。5、用Real-time PCR方法检测胃癌细胞转移相关的MMP9基因表达情况结果为BGC-823-sh ROS1细胞和SGC-7901-sh ROS1细胞中MMP9基因表达量较BGC-823细胞和SGC-7901细胞明显下降,分别为0.97vs 1.29及0.43vs1.00,差异有统计学意义,P0.01。6、TCGA数据库显示胃癌组织中ROS1 mRNA的表达显著高于癌旁正常组织中的表达(P0.0001)。ROS1高表达与更高的组织学分级(P=0.014)、更高的T分期、N分期、M分期及TNM分期相关(P均0.0001)。ROS1高表达预后与其低表达患者比较,预后不良。393例胃癌患者中仅有2例患者检测出ROS1基因扩增。7、qRT-PCR结果显示ROS1在37例胃癌患者中的mRNA表达显著高于其在正常胃粘膜中的表达。8、免疫组化结果显示在126例胃癌组织中仅检测到5例ROS1蛋白高表达,ROS1高表达患者的共同特征为年龄均在60岁以上,均有淋巴结转移,且为Ⅱ期以上的进展期胃癌。结论:1、人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞中存在ROS1基因高表达,ROS1基因被敲除后胃癌细胞增殖、侵袭与转移能力被抑制,细胞凋亡显著增加。2、ROS1基因沉默后,胃癌细胞bcl-2/bax比例失衡,激活caspase-PARP途径,导致细胞凋亡增加。ROS1基因通过调节bcl-2/bax比例,抑制caspase-PARP途径活化,抑制胃癌细胞凋亡,促进其增殖。3、ROS1基因通过激活细胞内Twist,Snail,Slug基因,直接或间接下调胃癌细胞E-cadherin表达,促使胃癌细胞发生EMT,促使胃癌MMP9表达增加,增强其侵袭、迁移能力。4、ROS1基因在胃癌内通过激活PI3K/AKT信号传导通路启动肿瘤增殖信号、抑制细胞凋亡,促进胃癌细胞发生EMT。5、TCGA数据资料显示胃癌组织中ROS1mRNA表达显著高于癌旁正常组织,胃癌组织中ROS1mRNA表达与组织学分级、T分期、N分期、M分期、TNM分期相关,胃癌组织中ROS1mRNA高表达与患者不良预后相关。胃癌患者中ROS1基因扩增较为罕见。与正常胃粘膜组织相比,ROS1mRNA在胃癌组织的表达显著升高。6、免疫组化检测结果显示胃癌组织中ROS1蛋白表达为3.97%。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R735.2

手机知网App
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 姜江;曾志坤;石博文;潘召城;颜凌;王宇杰;张欢;;玻璃动力学分析方法研究胃癌细胞运动学特点[J];诊断学理论与实践;2019年06期
2 李睿;龚琳;李庚;潘国庆;;幽门螺杆菌感染与胃癌细胞侵袭转移的关系研究[J];实用癌症杂志;2020年01期
3 施莉;胡丽瑜;钟定福;郭存果;施小英;;联合靶向阻断miR-29b/92b/106b抑制胃癌细胞生长及迁移[J];中国病理生理杂志;2018年11期
4 吴涛;段晓剑;田宇;陈海旭;徐志宏;刘静;王卫华;朱玲玲;王刚石;;低氘环境对胃癌细胞生长影响的体外实验[J];中国应用生理学杂志;2017年01期
5 查郎;彭旭东;王子卫;;纺锤菌素抑制胃癌细胞的侵袭和转移[J];基础医学与临床;2017年05期
6 ;喝米酒能防胃癌[J];益寿宝典;2017年13期
7 ;常吃西红柿能防治胃癌[J];家庭医药.快乐养生;2017年07期
8 ;养生月报[J];科学养生;2017年09期
9 刘菊香;成祥林;陈铭;;细胞因子诱导的杀伤细胞对胃癌细胞的杀伤作用的实验研究[J];中华临床医师杂志(电子版);2013年11期
10 张慧;刘理礼;王亚芳;张宏博;聂勇战;吴开春;樊代明;;缺氧在诱导胃癌细胞上皮间质转化及侵袭中的作用[J];现代肿瘤医学;2013年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 刘秀芳;吴华彰;胡莹;公丕海;宊伟;沈小慧;郑颖;樊红;;LncRNA LINC00651表遗传调控E-cadherin诱导胃癌细胞侵袭转移分子机制[A];江苏省遗传学会2016年学术年会论文摘要集[C];2016年
2 杨小强;季英兰;周明;史有喆;李玉达;项国伟;马剑;;幽门螺杆菌对胃癌细胞VEGF—C表达的影响[A];中国中药杂志2015/专集:基层医疗机构从业人员科技论文写作培训会议论文集[C];2016年
3 陈韶华;吴灵娇;吴鸿儒;吴雅春;厉有名;;低浓度酒精对胃癌细胞活性及周期抑制[A];中华医学会第12次全国内科学术会议论文汇编[C];2009年
4 陈韶华;吴灵娇;吴鸿儒;吴雅春;厉有名;;低浓度酒精对胃癌细胞活性及周期抑制[A];第二届浙江省消化病学术大会论文汇编[C];2009年
5 刘肇宁;刘瀛龙;爱民;吕有勇;;大蒜素对胃癌细胞基因的表达调控[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
6 李庆明;闵存云;;“胃康宁”对胃癌细胞生长和VEGF及其受体表达作用[A];中国中西医结合学会第七次全国实验医学学术研讨会论文汇编[C];2004年
7 楼俪泓;;15-羟基前列腺素脱氢酶对胃癌细胞周期影响的试验研究[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
8 韩霜;雷婷;韩者艺;刘杰;郭雪艳;丁睿;吴开春;丁杰;樊代明;;分化抑制因子1对胃癌细胞恶性生物学行为的影响[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(下册)[C];2007年
9 徐细明;吴耀贵;戈伟;于皆平;;阿霉素对胃癌细胞蛋白激酶B表达的影响[A];第二届湖北省肿瘤靶向治疗学术会议论文选[C];2007年
10 谢少茹;沈洪;赵崧;张国新;郝波;刘增巍;施瑞华;;黄芪多糖对胃癌细胞的抑制作用及其机制[A];中华中医药学会脾胃病分会第十九次全国脾胃病学术交流会论文汇编[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 陆叶清;发现抑制胃癌细胞的重要基因[N];上海科技报;2010年
2 张中桥;胃癌细胞MDR机制研究取得新进展[N];中国医药报;2007年
3 记者 衣晓峰 通讯员 乔蕤琳;维生素E衍生物能抑制胃癌细胞生长[N];健康报;2010年
4 王振岭;我国抑制胃癌细胞生长研究有重要发现[N];中国医药报;2002年
5 衣晓峰 乔蕤琳 记者 赵宇清;抑制胃癌细胞生长研究有新发现[N];黑龙江日报;2010年
6 王雪飞;黄连素能“诱杀”胃癌细胞[N];健康报;2004年
7 王振岭;7种抗癌药体外抑制胃癌细胞的研究有新发现[N];医药经济报;2002年
8 王振岭;抗癌药抑制胃癌细胞生长研究获重要发现[N];中国中医药报;2002年
9 吴一福 苏玉军;白藜芦醇可诱导胃癌细胞脱落凋亡[N];中国医药报;2005年
10 郭云平;癌症病人吃甲鱼[N];中国食品质量报;2001年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 刘军言;NETO2调控胃癌侵袭转移的作用及分子机制研究[D];中国人民解放军陆军军医大学;2019年
2 覃中毅;溴结构域蛋白BRD4维持胃癌细胞高侵袭转移特性的作用及机制研究[D];中国人民解放军陆军军医大学;2019年
3 乔京京;ROS1基因对胃癌细胞生物学行为的影响及其分子机制的研究[D];中国医科大学;2019年
4 黄姗姗;YAP1-AGK正反馈环路促进胃癌细胞进展的分子机制[D];南昌大学;2019年
5 刘搏芳;LRRN1对胃癌生物学行为的影响及其机制研究[D];中国医科大学;2019年
6 郭海建;脑衰反应调节蛋白4亚型对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响[D];武汉大学;2016年
7 蔡智慧;microRNA-375的上调通过调节AEG-1抑制胃癌细胞的增殖[D];武汉大学;2017年
8 冯静;miR-630抑制胃癌细胞侵袭迁移和EMT机制的研究[D];郑州大学;2018年
9 权晓强;miR-198通过下调TLR4抑制胃癌细胞的增殖和迁移[D];郑州大学;2018年
10 周颀;miRNA-181b参与TGF-β诱导胃癌细胞上皮间质转化的机制研究[D];苏州大学;2018年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 洪义东;铜绿假单胞菌注射液对胃癌细胞株增殖能力的影响及相关机制[D];江苏大学;2019年
2 陈梦娇;支架蛋白IQGAP1通过调控上皮间质转化对胃癌细胞顺铂耐药性的影响[D];江苏大学;2019年
3 刘骏强;下调蛋白IQGAP1通过HIF1α/VEGF-A通路抑制胃癌细胞上皮间质转化[D];江苏大学;2019年
4 宋书铮;CD133与PI3Kp85相互作用促进胃癌细胞化疗耐药的实验研究[D];上海交通大学;2016年
5 李盖天;miR-200c通过PI3K/AKT信号通路抑制胃癌细胞上皮间质转化的研究[D];甘肃中医药大学;2019年
6 施琪琪;磷脂结合蛋白Annexin A6在胃癌细胞自噬中的作用及其机制研究[D];浙江大学;2019年
7 何嘉敏;MiR-129-5p通过HOXC10调控CCND1从而影响胃癌细胞的增殖[D];浙江大学;2019年
8 周怡乐;桦木酸通过下调S期激酶相关蛋白2抑制胃癌细胞转移侵袭的机理研究[D];广州中医药大学;2019年
9 王天石;蜂王浆蛋白体外消化产物对胃癌细胞SGC-7901的抑制及其应用[D];锦州医科大学;2019年
10 修莹莹;MicroRNA-147b-5p对胃癌细胞EMT、侵袭及迁移能力影响的研究[D];锦州医科大学;2019年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026