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《中国医科大学》 2019年
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创伤后癫痫形成的促发因素及机制研究

王莹  
【摘要】:目的:创伤后癫痫(PTE)形成的具体分子细胞学机制仍不清楚。目前的挑战是能否发现一些可能被忽略的对创伤后癫痫形成有促进作用的可干预的因素,预防其发生发展。外周感染使很多中枢神经系统损伤的结局恶化。然而,外周感染对创伤后癫痫形成的影响仍不清楚。本研究假设脑创伤(TBI)慢性期的外周感染能够作为对已由TBI启动的大脑的二次打击,增加病灶周围皮层和海马的神经元兴奋性,再次激活星形胶质细胞,促进创伤后癫痫形成及其他共患病的发生发展。星形胶质细胞在神经炎症中起关键作用,也是外周感染促进创伤后癫痫的重要环节,但其具体机制不详,本研究第二方面调查了在培养的星形胶质细胞中sigma-1受体(Sig-1R)活化对脂多糖(LPS)诱导的炎症反应的影响。另一方面,有证据表明创伤后癫痫形成与抑制性中间神经元的丢失和抑制性神经元网络的破坏有关。然而,关于TBI后脑内特殊中间神经元亚型,钙视网膜蛋白(CR)免疫反应阳性神经元和CR相关基因网络的改变,及其与创伤后癫痫形成的关系,仍不清楚。本研究的另一目的是明确TBI慢性期大脑皮层和丘脑的CR网络的改变,为进一步探讨创伤后癫痫形成的机制奠定了基础。方法:第一部分,制作成年大鼠侧位液压冲击损伤(FPI)模型。TBI后6周行T2加权MRI并分型:局灶炎症型[focal inflammatory(TBI_(FI))]和空腔形成型[cavity-forming(TBI_(CF))]。TBI后8周,两种表型大鼠随机接受一次脂多糖(LPS;5mg/kg)或生理盐水(Veh)腹腔注射,假手术组只接受生理盐水注射,最终得到以下5个实验分组:假手术组(sham),TBI_(FI)-Veh,TBI_(FI)-LPS,TBI_(CF)-Veh,TBI_(CF)-LPS组。TBI后12周,即LPS注射后4周,依次进行旷场实验(OF),高架迷宫实验(EPM),糖水偏好实验(SPT)和强迫游泳实验(FST)。TBI后16周,开始进行为期4周的视频脑电图(vEEG)监测,之后进行Morris水迷宫实验(MWM)。最后进行戊四氮(PTZ)癫痫敏感性试验,并于PTZ注射后2小时处死大鼠,取脑组织进行尼氏染色和c-Fos免疫组化染色。应用TBI后6周的MRI和23周的尼氏染色切片制作皮层展开地图,评价皮层病灶的范围和进展程度。通过分析脑内c-Fos免疫反应性的表达,评价PTZ注射后2小时神经元激活的空间分布情况。第二部分,进行星形胶质细胞的原代培养,之后通过检测一氧化氮、活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)的水平评估激活sig-1R是否对LPS诱导的星形胶质细胞炎症反应有抑制作用。接下来检测了Nrf2的表达,Nrf2是细胞防御氧化应激关键因子之一,并与星形胶质细胞释放炎症介质相关。此外,还检测了血红素加氧酶-1(HO-1)的表达,HO-1是一种能被Nrf2激活的具有抗氧化、抗凋亡和抗炎作用的氧化还原敏感酶。最后检测了核因子κB(NF-κB)的表达,NF-κB能刺激促炎性细胞因子的释放,其转录活性可以由Nrf2调节。进而分析sig-1R的激活通过星形胶质细胞抗氧化/氮化和抗炎作用的可能机制。第三部分,制作成年大鼠侧位FPI模型。TBI后1月取脑组织进行尼氏染色、NeuN和CR免疫组化染色。对于大脑皮层,首先用尼氏染色切片制作皮层病灶的二维展开地图,然后同侧大脑皮层CR阳性神经元的定量分析呈现于上述展开地图上。同时应用生物信息学分析探讨了TBI后3月病灶周围皮层CR相关基因表达的变化,并对其中2个基因(Tubb3和Reln)应用定量逆转录酶聚合酶链反应(RT-qPCR)方法进行了定量分析。对于丘脑,网状核(RT)体积依据Cavalieri原则评估,其内CR阳性神经元的数量应用无偏性体视学定量分析。同时评估距离前囟-1.80 mm水平的CR免疫染色切片中腹前核(VA)-腹外侧核(VL)复合体的面积及其内CR标记的神经纤维的密度。我们还应用RT-qPCR方法对另一组大鼠(TBI后6月)丘脑神经递质受体和调节因子的基因表达进行分析,应用生物信息学方法探讨了TBI后3月丘脑CR相关基因网络的改变。结果:第一部分,TBI后6周进行的T2加权MRI提示53%的TBI大鼠表现为TBI_(FI)表型,47%为TBI_(CF)表型。旷场实验中,TBI-Veh组与假手术组之间没有差异。然而,与假手术组比较,TBI-LPS组大鼠,不论何种表型,均在内侧区停留时间缩短(p0.01),外侧区停留时间延长(TBI_(FI)-LPS vs.假手术组,p0.05;TBI_(CF)-LPS vs.假手术组,p0.01)。而且,TBI-LPS组大鼠在外侧区停留时间比TBI-Veh组长(p0.05)。高架迷宫实验中,与假手术组比较,TBI-Veh和TBI-LPS组在开放臂的滞留时间均缩短(p0.05)。Morris水迷宫实验中,与假手术组比较,TBI-Veh和TBI-LPS组大鼠找到水下隐藏平台的潜伏期延长,且在目标象限停留时间减少(p0.05)。vEEG监测显示2只大鼠出现自发性癫痫发作,均来自于TBI_(FI)-Veh组。PTZ试验中,TBI-Veh和TBI-LPS组在癫痫发作出现率上没有差别,但TBI_(FI)-LPS组癫痫发生率高于TBI_(FI)-Veh组(p0.05)。PTZ诱导的痫性发作累计持续时间TBI-LPS组长于TBI-Veh组(p0.01),尤其见于TBI_(FI)表型(p0.05)。TBI-LPS组,组织学展开皮层病灶的面积是MRI展开皮层病灶面积的111%(p0.05),这种进展主要见于TBI_(FI)表型(p0.05)。与假手术组比较,TBI-Veh组大鼠病灶周围皮层,不论头侧(p0.01)或尾侧(p0.05),均表现出更多的c-Fos表达。与TBI-Veh组相比,TBI-LPS组大鼠在对侧相应皮层的头侧(p0.01)和病灶周围皮层的尾侧(p0.05)有更显著的c-Fos表达。TBI-LPS组双侧c-Fos表达的增加,在II-IV层比V-VI层更加明显,头侧比尾侧更为显著。TBI_(FI)表型和TBI_(CF)表型比较,前者显示出病灶周围皮层和对侧相应皮层的神经元兴奋性更高的趋势。双侧齿状回神经元激活的出现率,TBI-LPS组高于TBI-Veh组(p0.05),主要来自于TBI_(FI)表型(p0.05)。第二部分,LPS显著升高星形胶质细胞中iNOS和TNF-α的表达水平,而选择性的Sig-1R激动剂SA4503可逆转LPS的这种作用,主要通过下调iNOS和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达并上调培养的星形胶质细胞中的谷胱甘肽(GSH)来减轻LPS诱导的炎症反应和氧化/亚硝化应激。为了研究SA4503引起这些效应的机制,接下来通过Western印迹检测了核因子类红细胞衍生的2类2(Nrf2)和血红素加氧酶1(HO-1)的表达,发现SA4503处理显着增加了Nrf2和HO-1的表达,提示星形胶质细胞中Sig-1R激活的抗氧化/亚硝化应激和抗炎作用部分由Nrf2和HO-1激活介导。第三部分,大脑皮层方面,TBI后1月,形态学上皮层病灶内或其周围区域的CR阳性神经元呈深染,胞体变小或不规则,突起短小、呈节段性或缺失。展开地图显示皮层病灶的部位和分布与我们之前的研究结果一致,覆盖听觉、视觉、躯体感觉和顶叶皮层,但是病灶的大小变化多样。皮层病灶核心的CR阳性神经元丢失最严重,而病灶周围或远隔区域CR神经元的数量变化不大,甚至增多。CR神经元丢失形式多样,从呈现整个大脑皮层广泛而全面的丢失到选择性的局部皮层区域丢失,表现不一。TBI后3月,病灶周围皮层CR相关基因的表达下调,这些下调的基因生成的网络涉及一系列功能如突触传递、核周体、学习和记忆、凋亡过程及认知功能等。从这些基因中选取2个基因(Tubb3 and Reln)进一步进行RT-qPCR定量分析,结果显示TBI后2月病灶周围皮层Reln呈现上调,Tubb3显示下调倾向。对于丘脑,TBI后1月,同侧RT体积显著下降(p0.001),双侧RT内CR阳性神经元严重丢失(同侧,p0.001;对侧,p0.05)。RT的体积下降和RT内CR神经元的丢失之间无明显相关性。双侧VA-VL(同侧,p0.01;对侧,p0.05)CR标记神经纤维的密度均明显减少,尤其见于同侧核团及核团的外侧。TBI后同侧VA-VL内CR神经纤维的下降与同侧RT的CR神经元的丢失有相关性(r=0.7000,p0.05,n=9)。TBI慢性期,丘脑神经递质受体和调节因子的基因和CR相关基因的表达均呈现下调,生物信息学分析提示神经系统疾病和生物体损伤2个网络的改变,这些改变可以被2个可能的调节因子控制:神经调节蛋白家族和尼古丁。结论:综上所述,TBI慢性期的外周感染可以作为促进因素,增加创伤后癫痫易感性,加重焦虑样行为,促进皮层病灶的进展扩大,机制可能与病灶周围皮层和双侧齿状回的神经元兴奋性增高,以及星形胶质细胞的再次激活有关。星形胶质细胞中Sig-1R激活的抗氧化/亚硝化应激和抗炎作用部分由Nrf2和HO-1激活介导。另一方面,本研究数据首次定量证实了TBI慢性期大脑皮层和丘脑CR免疫反应性的退行性变及CR相关基因网络的改变,对明确TBI继发性损害和创伤后癫痫形成的机制方面提供了重要的依据。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R651.15;R742.1

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