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《中国医科大学》 2019年
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环六亚甲基二乙酰胺诱导蛋白HEXIM1调控头颈部鳞癌干细胞休眠激活机制的实验研究

任子涵  
【摘要】:目的:目前对于癌细胞的化疗都以增殖期癌细胞为目标,对于G0期(休眠期)癌细胞作用不明显,且在一定条件下引起再发。癌细胞进出G0期机制不明确,如果探明癌细胞进出细胞周期的机理就可以通过调控癌细胞长时间停留在G0期(休眠期)而不增殖,从而达到癌细胞与机体共存的目的。阐明癌干细胞进出G0期机理就有可能将癌干细胞驱除Go期到增殖期,应用抗癌剂杀灭残留癌细胞,从而达到防止再发的目的。因此深入探讨癌干细胞细胞周期调控的机制对改善头颈部鳞癌的疾病转归及研发新的分子靶向药物都具有重要意义。近年研究发现SOX2与肿瘤形成关系密切,其异常表达与肺癌、乳腺癌、食管癌、鼻咽部肿瘤的发生密切相关~([1])。SOX2涉及肿瘤发生发展过程中的表观遗传修饰及干细胞特性的获得~([3])。日本学者通过外源性导入Oct4、Sox2、c-myc和Klf4将小鼠成纤维细胞诱导为具有胚胎干细胞特性的多能性干细胞即iPS细胞~([4])。次年他们又使用同样的方法将人皮肤成纤维细胞和人新生儿成纤维细胞重构为iPS细胞~([5,6])。因此SOX2也被视为干细胞标志物~([7])。5氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)是广泛应用于临床的细胞周期特异性药,它主要作用于S期,是恶性肿瘤化疗的基础用药,许多的化疗方案都含氟尿嘧啶类药物。Vera及本研究组等发现5-FU富集的耐受化疗癌细胞具备诸多干细胞特性,如形成克隆的能力较强,富含SP表型细胞,高表达干细胞标记物,低表达分化标记物等~([8,9])。无血清培养:已有报道指出,一些哺乳动物成体干细胞可以在无血清培养基(SFM)内呈非黏附性球形生长~([10])。P-TEFb复合体磷酸化CTD-Ser2触发转录的活性延伸,所以CTD-Ser2磷酸化和转录活性延伸是真核细胞基因表达的标志~([15])。2008年,Zhou研宄发现~([16]):在细胞有丝分裂后末期,当阻断P-TEFb被募集到染色体上的过程,细胞被阻滞在G0期,无法进入S期。因此CTD-Ser2磷酸化可视为细胞由休眠期进入增殖期(激活期)的标志,反之则为休眠期。近年来Pol II调控的基因转录循环机制成为研究热点,环六亚甲基二乙酰胺诱导蛋白HEXIM1作为一种潜在的肿瘤抑制因子~([23-25])在乳腺癌的增殖、转移及急性白血病发病机制方面被深入研究,而HEXIM1或P-TEFb在癌细胞及癌干细胞休眠与激活调控机制方面的研究确鲜有报道。本研究以人咽部鳞癌细胞Fadu细胞为实验对象,利用5氟尿嘧啶作用及无血清培养对Fadu细胞干细胞的富集及纯化作用,观察干细胞转录因子SOX2表达的动态变化,以及干细胞富集和分化过程中HEXIM1、正性转录延长因子P-TEFb及磷酸化CTD-Ser2氨基酸的表达情况。通过转染HEXIM1检测其对P-TEFb、CTD-Ser2p的调控作用。同时探讨HEXIM1蛋白因子对Fadu细胞干细胞由G0期向S期转化即Fadu细胞干细胞休眠与激活的调控机制。材料与方法:1、免疫组织化学染色检测HEXIM1在喉癌组织中的表达。2、10%FBS及青霉素与链霉素各100U/ml MEM培养基37℃、5%CO2进行Fadu细胞培养。3、倒置显微镜观察人咽部鳞癌Fadu细胞形态。4、MTT法测定5-Fu对Fadu细胞增殖的半数抑制率(IC50)的药物浓度及打击时间。5、依照5-Fu(IC50)作用Fadu细胞,以作用前、作用后恢复0h、48h为时间点构建Fadu细胞5-Fu打击恢复细胞模型。6、间接免疫荧光染色检测CD133、CD44、SOX2、CTD-Ser2p在Fadu细胞5-Fu打击恢复细胞模型中的表达。7、无血清培养法(SFM)培养Fadu细胞,收集悬浮Fadu干细胞球。8、利用Lipofectamine 2000试剂瞬时转染HEXIM1的siRNA。9、Western blot、Real-time PCR检测SOX2、HEXIM1、CDK9、Cyclin-T1和CTD-Ser2p的表达水平。10、流式细胞仪检测细胞周期变化。11、所有数据采用3次独立实验结果,以均值±标准差(x±s)进行表示。采用SPSS17.0统计分析软件进行统计学分析。组间比较采用t检验,P0.05有统计学意义。实验结果:1、HEXIM1在头颈部鳞癌中阳性表达且表达趋势与细胞分化程度相关应用免疫组织化学染色法对喉癌及癌旁组织进行HEXIM1染色发现HEXIM1在正常喉鳞状上皮和喉癌细胞中均为细胞核表达,HEXIM1在正常喉鳞状上皮高表达,而在基底层中阴性表达,在喉癌组织中,HEXIM1在癌巢中高表达。2、5氟尿嘧啶抑制人咽部鳞癌细胞Fadu细胞增殖应用5氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)按0-1000μg/ml药物浓度梯度分24h、48h及72h作用于Fadu细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率发现,与对照组相比,5-Fu作用后Fadu细胞增殖受到不同程度的抑制,并且这种抑制与药物浓度和作用时间呈正相关。根据MTT检测结果,本实验选定1000μg/ml、作用48小时作为5-FU对Fadu细胞的半数抑制量(IC50)。3、5-Fu作用可富集Fadu细胞的干细胞通过对5-Fu(IC50)作用前后Fadu细胞进行干细胞标志物SOX2免疫荧光染色发现,5-Fu作用前SOX2几乎不表达,5-Fu作用后SOX2表达阳性细胞明显增多。Western blot法检测5-Fu作用前后Fadu细胞SOX2表达情况发现,与作用前相比,5-Fu作用后,SOX2表达明显增高,在作用后恢复正常培养48h,SOX2表达明显减少。Realtime PCR检测结果与Western blot结果一致。同时我们应用有明确干细胞纯化作用的无血清培养法对Fadu细胞进行干细胞提取,并且应用Western blot法检测SOX2的蛋白表达发现无血清培养组SOX2明显高表达。参照无血清培养组结果提示,5-Fu作用后的Fadu细胞高表达干细胞标志物SOX2,即5-Fu作用可富集Fadu细胞的干细胞。4、HEXIM1、CTD-Ser2p、P-TEFb与Fadu细胞细胞周期调控相关通过Western blot及Realtime PCR法对5-Fu作用前后的Fadu细胞进行HEXIM1、CTD-Ser2p、CDK9及Cyclin-T1表达的检测发现,5-Fu作用后恢复0h较5-Fu作用前HEXIM1表达明显增高,CTD-Ser2p、CDK9及Cyclin-T1表达相应减少。5-Fu作用后恢复48h较恢复0h,HEXIM1表达明显下调,而CTD-Ser2p、CDK9及Cyclin-T1表达相应上调,即HEXIM1表达变化趋势与CTD-Ser2p、CDK9及Cyclin-T1完全相反。结果提示5-Fu作用影响HEXIM1、CTD-Ser2p、CDK9及Cyclin-T1的表达。细胞周期检测结果提示,5-Fu作用后恢复0h较5-Fu作用前G0期细胞比例显著增多,S期细胞比例明显减少,恢复48h组相比恢复0h组S期细胞比例明显增多,G0期细胞比例显著减少。以上结果提示,Fadu细胞的干细胞由G0期进入S期与HEXIM1、CTD-Ser2p、CDK9、CyclinT1存在相关性。5、Fadu细胞中HEXIM1通过抑制P-TEFb活性抑制转录延伸活性利用干扰序列建立瞬时沉默HEXIM1基因的Fadu细胞系Fadu/Si及其空白载体对照细胞系Fadu/N、Fadu/NC。通过Western blot及Realtime PCR法对沉默HEXIM1基因的Fadu细胞进行HEXIM1、CTD-Ser2p、CDK9及Cyclin-T1蛋白及RNA水平检测发现,HEXIM1表达下调,相应CTD-Ser2p、CDK9及Cyclin-T1表达上调,说明HEXIM1能够负向调控CTD-Ser2p、CDK9及Cyclin-T1的表达。结果提示HEXIM1通过抑制P-TEFb活性抑制转录延伸活性。6、HEXIM1通过抑制转录延伸活性阻碍Fadu细胞的细胞周期进程应用流式细胞术对瞬时沉默HEXIM1基因的Fadu细胞进行细胞周期检测发现,与对照组相比,沉默HEXIM1的Fadu细胞S期细胞比例明显增多,G0期细胞比例显著减少,提示DNA合成增加,Fadu细胞由G0期向S期转化。结合HEXIM1基因沉默组HEXIM1、CTD-Ser2p、CDK9及Cyclin-T1表达的变化趋势。以上结果提示,Fadu细胞中HEXIM1通过抑制P-TEFb调控的信号通路活性抑制转录延伸活性,阻碍休眠期Fadu细胞向增殖期转化。结论:1、HEXIM1在喉鳞状上皮与喉鳞癌中表达,且表达与细胞分化程度呈正相关。2、HEXIM1通过抑制P-TEFb,下调CTD-Ser2p的表达,进而阻碍Fadu细胞干细胞由休眠期向增殖期转化,即HEXIM1有稳定癌干细胞在休眠期作用。3、抑制HEXIM1可促进癌干细胞由休眠期进入增殖期,而在癌干细胞被驱入增殖期后则易于被抗癌药杀灭,本研究为减少和消除癌干细胞提供了新的途径。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R739.91

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