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《中国医科大学》 2019年
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普通肝素对细胞外组蛋白介导的脓毒症肠道微循环障碍的保护性作用研究

朱承睿  
【摘要】:研究背景及目的:脓毒症是由感染引发的全身炎症反应,并诱发机体应答反应失衡,引起致命的器官功能损伤。微循环由微动脉、微静脉及其间的毛细血管组成,是维持机体稳态的重要场所,正常的微循环功能是宿主得以维持稳态及病原体控制的重要中间环节。微循环功能异常既是脓毒症的病理生理学表现,也是脓毒症发生发展的始动因素之一。微循环的主要结构性细胞为内皮细胞,内皮细胞是脓毒症时炎症和凝血反应交互作用的场所,是调控“免疫血栓”的重要结构,内皮细胞的结构、功能异常是导致微循环障碍的重要因素。肠道是脓毒症及各种类型休克时被首要牺牲血流灌注的器官,易发生微循环障碍,并进一步引起肠屏障障碍,不仅导致肠道本身器官功能障碍,还可加重脓毒症及其他远隔器官功能损伤的发生。组蛋白是构成真核生物细胞中染色质的结构性蛋白,是带有正电荷的碱性蛋白质。细胞外组蛋白来源于细胞内染色质解聚导致的核小体释放,在炎症、损伤发生时细胞外组蛋白浓度显著增高。细胞外组蛋白是一种损伤相关模式分子(DAMPs),可引起机体广泛的细胞损伤,特别是内皮细胞的损伤,引起白细胞募集与粘附,并激活免疫细胞的Toll样受体,激活其介导的细胞内信号转导途径,导致炎症因子释放,可激活血小板并引起凝血功能障碍。上述作用说明细胞外组蛋白可能是在炎症及损伤等发生时参与机体微循环障碍重要的中间环节。普通肝素是临床常用抗凝药物,且作为带有强烈负电荷的生物学分子,可与带正电荷的组蛋白结合,减弱组蛋白介导的毒性作用及炎症反应。故肝素与细胞外组蛋白结合,降低细胞外组蛋白的毒性作用,并改善微循环可能是对脓毒症的保护作用之一。本研究拟通过静脉注射LPS建立大鼠脓毒症模型,观察普通肝素对脓毒症时肠道微循环、细胞外组蛋白含量的影响;予大鼠组蛋白静脉注射造模,观察组蛋白直接刺激对大鼠肠道微循环及内皮细胞损伤的影响及肝素的保护性作用;以组蛋白刺激人肠微血管内皮细胞(HIMEC),探讨普通肝素对组蛋白损伤HIMEC的保护作用及内皮细胞凝血激活及损伤标志物vWF的影响,并探讨普通肝素是否可通过抑制组蛋白导致钙离子内流的机制减少HIMEC损伤及凝血激活。研究方法:1、在体实验:普通肝素对脓毒症大鼠细胞外组蛋白的影响及肠道微循环障碍的保护性作用。24只雄性Wistar大鼠,随机数字表法分为3组,分别为对照组、脓毒症组、脓毒症肝素治疗组,每组8只。脓毒症组模型建立采用10mg/kg LPS一次性静脉注射,脓毒症肝素治疗组在造模后给予100IU/kg*h肝素溶液持续静脉泵入。连续观测6小时内大鼠心率、血压变化,开腹后以IDF显微录像设备观察分析实验0、2、4、6小时大鼠回肠浆膜层微循环,实验6小时剖开大鼠回肠,观测粘膜层微循环。6小时过量戊巴比妥注射处死大鼠,留取血浆标本。ELISA法测定大鼠血浆总组蛋白含量变化,Western blot法测定血浆H_3、H_4型组蛋白含量变化。2、在体实验:细胞外组蛋白对大鼠肠道微循环和内皮细胞损伤的影响及普通肝素的保护性作用。24只雄性Wistar大鼠,随机数字表法分为三组,分别为对照组、组蛋白组、组蛋白造模肝素治疗组,每组8只。组蛋白组模型建立采用30mg/kg小牛胸腺组蛋白一次性静脉注射,组蛋白造模肝素治疗组在造模后予以100IU/kg*h肝素溶液。连续观测6小时内大鼠心率、血压变化,开腹后以IDF显微录像设备观察分析实验0、2、4、6小时大鼠回肠浆膜层微循环,实验6小时剖开大鼠回肠,观测粘膜层微循环。6小时过量戊巴比妥注射处死大鼠,留取血浆标本及回肠组织标本。ELISA法测定大鼠血浆sTM,vWF含量,透射电镜观察回肠微血管内皮细胞超微结构改变。3、体外实验:普通肝素对细胞外组蛋白介导的人肠微血管内皮细胞损伤的保护性作用及机制研究。选择人肠微血管内皮细胞(HIMEC),分为4组:对照组,组蛋白刺激组,组蛋白+肝素组及肝素组。在加入刺激因素前加入10IU/ml普通肝素预处理,加入PBS溶解的小牛胸腺组蛋白刺激HIMEC。以MTT法测定不同浓度组蛋白对HIMEC细胞活力影响,PI染色法以流式细胞技术及荧光显微镜测定HIMEC存活率。免疫荧光染色法观察HIMEC胞浆中vWF含量变化,ELISA法测定HIMEC细胞培养上清液中vWF浓度。以Fura 2-AM荧光染色法测定在含钙及不含钙缓冲液中细胞内游离钙离子浓度。结果:1、(1)脓毒症大鼠心率增快,血压降低,普通肝素治疗未改善脓毒症大鼠心率、血压变化。(2)脓毒症组大鼠肠道浆膜层及粘膜层均出现明显微循环障碍。脓毒症组与对照组浆膜层微循环分析数据相比,造模后2小时TVD,2、4、6小时PVD、PPV及MFI均有明显差异。造模6小时粘膜层微循环,脓毒症组与对照组相比TVD、PVD及PPV均有统计学差异(3)肝素治疗可改善脓毒症大鼠肠道浆膜层及粘膜层微循环障碍。脓毒症肝素治疗组造模6小时,浆膜层TVD、PVD、MFI,粘膜层TVD、PVD、PPV及MFI与脓毒症组相比具有统计学差异。(4)脓毒症组大鼠血浆总组蛋白(脓毒症组OD=1.1±0.64,对照组OD=0.12±0.08)、H_3、H_4型组蛋白含量升高,肝素治疗脓毒症组血浆总组蛋白(OD=0.23±0.08)、H_3、H_4型组蛋白含量降低。2、(1)组蛋白组及组蛋白造模肝素治疗组大鼠心率、血压无明显变化。(2)组蛋白组大鼠肠道浆膜层及粘膜层均出现明显微循环变化。浆膜层在造模2小时组蛋白组与对照组相比,PVD、MFI明显降低,4小时PVD、PPV及MFI明显降低,6小时TVD、PVD、PPV及MFI均具有统计学差异。造模6小时分析粘膜层微循环,组蛋白组与对照组相比TVD、PVD及PPV均有统计学差异。(3)肝素治疗可改善组蛋白刺激大鼠肠道浆膜层及粘膜层微循环障碍。组蛋白造模肝素治疗组6小时浆膜层TVD、PPV,4、6小时PVD相比于组蛋白组具有统计学差异。6小时粘膜层TVD、PVD、PPV及MFI与组蛋白组相比有统计学差异。(4)组蛋白刺激大鼠血浆sTM(1.14(0.93,3.11)ng/ml),vWF(688.71±339.41pg/ml)含量显著升高,肝素治疗可显著降低血浆sTM(0.30(0.07,0.81)ng/ml),vWF(242.32±76.11 pg/ml)含量。(5)组蛋白刺激大鼠回肠微血管内皮细胞超微结构损伤严重,肝素治疗可减轻回肠微血管内皮细胞超微结构损伤。3、(1)随组蛋白浓度增高,HIMEC细胞活力明显下降。(2)组蛋白刺激导致HIMEC存活率降低,肝素预处理可抑制组蛋白刺激导致的HIMEC死亡。(3)组蛋白刺激导致HIMEC胞浆内vWF含量降低,细胞培养上清液中vWF含量增加,即细胞胞浆内vWF外排。肝素预处理可明显抑制组蛋白刺激导致的HIMEC胞内vWF外排。(4)组蛋白刺激导致HIMEC细胞外钙离子内流,普通肝素预处理可抑制组蛋白刺激时细胞外钙离子内流。结论:1、普通肝素治疗改善脓毒症大鼠肠道微循环障碍,并降低脓毒症时血浆细胞外组蛋白含量。2、组蛋白刺激可引起大鼠肠道微循环障碍及内皮细胞损伤。普通肝素减轻组蛋白刺激引起的肠道微循环障碍及内皮细胞损伤。3、组蛋白可通过细胞外钙离子内流机制引起HIMEC细胞损伤及vWF外排。普通肝素可拮抗组蛋白刺激导致的细胞外钙离子内流,减弱组蛋白刺激引起的HIMEC细胞损伤及vWF外排。4、肝素通过拮抗细胞外组蛋白对内皮细胞的损伤改善脓毒症肠道微循环障碍。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R459.7

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