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《中国医科大学》 2019年
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负载BMP-9的nHA/ColⅠ/MWCNT支架用于大鼠骨缺损修复的实验研究

张然  
【摘要】:目的:创伤、肿瘤术后或先天畸形等原因造成的不同程度的颌面部骨缺损是口腔颌面外科常见疾病,这类疾病不但严重影响了患者言语、发音及进食等口颌系统的功能,同时,很大程度上影响了患者的美观和心理。在各类骨缺损修复的方法中,骨组织工程发挥着不可或缺的重要作用。支架材料、种子细胞以及促成骨的化学及细胞因子是骨组织工程中非常重要的三个因素。支架材料是骨组织工程的关键因素。作为理想的骨组织工程材料,应该具备良好的生物相容性和表面活性、优良的骨传导性和骨诱导性、合适的孔径和孔隙率以及机械强度高和可塑性强等特点,以起到更好地修复骨缺损的效果。新型支架材料的合成一直是骨组织工程研究的热点问题。随着纳米技术的发展,大量纳米材料被应用于组织工程支架的合成与研究。羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA)是人体和动物骨骼、牙齿的主要无机成分,具有良好的生物活性、生物相容性以及原位慢速生物可降解性,同时具备良好的骨传导和促成骨能力。从仿生学角度分析,纳米级羟基磷灰石性能更加优越,与人自体的羟基磷灰石尺寸更加接近,更易于吸附于其它材料表面形成化学键结合,从而制备出机械强度更高、生物学性能更好并且促成骨作用更明显的复合型支架材料。I型胶原(Collagen I,ColI)由于其绝佳的生物相容性而被广泛应用于各类成骨支架,其在体内易被吸收降解,对加入其中的细胞因子具有封闭保护作用,但是,由于强度不足,故而常与其它无机基质或强度较高的天然材料复合形成共混型复合支架。碳纳米管(Carbon Nanotubes,CNTs)又被称为―超级纤维‖,是一种新型纳米材料,CNTs有着极其优越的延展性,向其它材料中加入CNTs可明显提升材料的机械强度和延展性,CNTs的优越性能迅速受到材料学及医学生物学相关研究人员的广泛关注。骨形态发生蛋白9(Bone Morphogenetic Protein 9,BMP-9)越来越受到学者们的重视,BMP-9又称GDF-2(Growth Differentiation Factor 2),在已知的所有BMPs蛋白中,促成骨作用最强。目前对于将BMP-9应用于骨组织工程的研究逐渐增多,学者们采用不同方式构建负载BMP-9蛋白的复合型支架用于研究。本实验通过共混-冻干法合成纳米羟基磷灰石/Ⅰ型胶原/多壁碳纳米管(nHA/ColⅠ/MWCNT)复合支架,通过系列实验检测其自身性能;而后将BMP-9复合其中,通过体外及SD大鼠体内实验对其成促成骨性能进行检测。研究方法:一、nHA/ColⅠ/MWCNT复合支架的构建及性能检测:1、共混冻干法构建纳米羟基磷灰石/Ⅰ型胶原/多壁碳纳米管支架。3、万能力学测试仪测定支架的机械强度;4、取支架材料称重法计算吸水率及溶胀率,液体置换法计算孔隙率,扫描电镜测定支架孔径。5、支架材料的降解率及降解过程中PH值分析测定;6、SD大鼠骨髓间充质干细胞细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)的提取、培养、鉴定及成骨诱导。8、CCK-8试剂盒支架细胞毒性检测。9、SEM观察支架内细胞生长黏附情况。二、负载BMP-9的nHA/ColⅠ/MWCNT复合支架的构建及体外促成骨作用:1、BMP-9对BMSCs成骨分化的促进及Western Blot检测比较相关蛋白OCN、Akt及p-Akt的表达。2、负载BMP-9的nHA/ColⅠ/MWCNT新型支架的构建及BMP-9释放的检测。3、BMSCs接种复合BMP-9支架后细胞早期黏附率检测。4、BMSCs接种支架后的成骨诱导培养及相关蛋白表达的检测。三、负载BMP-9的nHA/ColⅠ/MWCNT复合支架的SD大鼠体内实验:1、SD大鼠颅骨临界骨缺损模型的制备及不同支架材料的植入。2、手术后影像学及组织学检测。四、实验数据的统计学分析。结果:一、nHA/ColⅠ/MWCNT支架的构建及性能检测:1、nHA/ColⅠ/MWCNT支架中多壁碳纳米管含量为1%wt时性能最佳,其压缩强度为5.91±0.58MPa,压缩模量为0.66±0.72MPa,吸水率为253±6%,溶胀率为34.5±1.3%,孔隙率为89.0±3.3%,孔径为129±23μm,随着支架材料中多壁碳纳米管含量的增高其压缩强度及压缩模量升高,吸水率、溶胀率、孔隙率及孔径均降低。2、nHA/ColⅠ/MWCNT支架材料扫描电镜观察显示,孔壁表面粗糙,植入细胞后,细胞生长活跃、增殖分裂正常,细胞可在材料表面黏附。CCK-8试剂盒检测,支架材料无细胞毒性,SD大鼠BMSCs增殖活跃。二、负载BMP-9的nHA/ColⅠ/MWCNT复合支架的构建及体外促成骨作用:1、细胞层面实验发现,BMSCs成骨诱导过程中,BMP-9刺激可使其ALP活性及OCN表达明显增高,且成骨相关通路蛋白Akt磷酸化水平升高。2、BMP-9负载于nHA/ColⅠ/MWCNT支架后,ELISA试剂盒检测BMP-9持续释放17天。3、新型复合支架细胞早期黏附率较对照组明显升高。4、细胞接种支架并诱导成骨后,较空白支架组ALP活性及OCN表达均升高,成骨相关通路蛋白Akt磷酸化水平升高,与细胞层面实验相吻合。三、负载BMP-9的nHA/ColⅠ/MWCNT复合支架的SD大鼠体内实验:经8周SD大鼠颅骨临界骨缺损修复实验,术后放射线及组织学检测对比,负载BMP-9的nHA/ColⅠ/MWCNT复合支架体现了良好的成骨性及生物相容性,与体外实验结果相吻合。结论:1、共混冻干法构建了nHA/ColⅠ/MWCNT支架,多壁碳纳米管含量为1%时,作为骨组织工程材料性能最佳。支架材料有良好的生物学性能及机械强度,降解性能符合骨组织工程学要求。2、将BMP-9负载于nHA/ColⅠ/MWCNT支架体外可促进BMSCs的成骨分化,其可通过Akt通路发挥作用。3、应用负载BMP-9的nHA/ColⅠ/MWCNT复合支架修复SD大鼠颅骨缺损,证实该复合支架应用于动物体内实验有显著成骨效应,可以作为组织工程方法修复骨缺损的选择方式。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R782

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