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《中国医科大学》 2019年
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基于泛基因组水平的痤疮丙酸杆菌的致病性和红霉素耐药性研究

赵书阳  
【摘要】:目的:痤疮丙酸杆菌(C.acnes)是人体皮肤表面的主要共生菌,具有维持皮肤稳态和调节皮肤免疫系统的作用,同时,该菌被认为是寻常痤疮的主要致病菌,且该菌的异位定植可引发严重疾病。C.acnes存在多亚型菌株共生的问题,对于研究不同亚型致病性造成困难。目前,C.acnes基因组水平的研究在国内仍属空白。本研究采取从单个样本中分离多株C.acnes菌株的方法,用于解决多亚型共生的问题,并首次对中国人群来源的多株C.acnes菌株进行全基因组测序、组装和注释,获得了中国人群来源C.acnes的全基因组信息。通过泛基因组学等生物信息学分析方法,解析我国人群来源的C.acnes菌株的进化关系和基因组特点,并探讨中国人群来源的C.acnes的致病性、耐药性和基因型之间的关系,旨在为维护我国人群的皮肤健康以及C.acnes引发疾病的防治提供理论依据。方法:从每个痤疮病人和健康志愿者面部擦拭样本的厌氧培养物中,分离2-6株C.acnes菌株;对分离得到的菌株进行全基因组测序;使用FastQC和NGS QC Toolkit对测序数据进行质量控制;使用SOAPdenovo、velvet和spades完成C.acnes的基因组拼接;使用prokka完成基因信息注释;使用BPGA完成泛基因组分析,包括幂律回归分析、进化树、COG分析、KEGG分析;使用MLST方法对C.acnes进行亚型分型;根据病人来源和正常人来源的C.acnes菌株的分布差异,筛选致病亚型;根据50株C.acnes菌株的附属基因热图,评价不同亚型菌株的基因组特点和差异;根据病人来源和正常人来源的C.acnes菌株基因组差异,筛选潜在的毒力因子;根据各菌株基因元件差异,分析红霉素耐药的潜在原因;使用纸片法验证所有菌株的红霉素耐药性;使用倍比稀释法检测红霉素耐药和非红霉素耐药菌株的mic值。结果:从10例中国人群面部皮肤棉拭子样本中分离得到C.acnes菌株50株。首次对来自中国人群的50株C.acnes菌株完成全基因组测序,测序深度100×,测序质量良好。测试了三款基因组组装软件,最终确定spades为最适软件,并使用spades和优化参数完成了50株C.acnes菌株的基因组组装。使用prokka完成50株菌株的基因注释。对50株菌株做幂律回归分析,证明C.acnes基因组保守,当分析12个以上单克隆时,核心基因数量减少和附属基因增加速度均放缓,该结果用NCBI数据库中50株已测序C.acnes菌株进行了验证。COG分析结果显示,痤疮丙酸杆菌的核心基因和附属基因的主要功能集中在维持细胞的复制转录和物质代谢两个方面。KEGG分析结果显示,痤疮丙酸杆菌大部分基因功能都与三大营养物质代谢、物质的转运和转录有关,病人来源的痤疮丙酸杆菌有更多的基因参与了碳水化合物代谢以及更少的基因参与了维生素合成。recA不适合用于C.acnes进化树构建。核心基因的进化树显示同一人来源的痤疮丙酸杆菌倾具有更近的进化关系。泛基因组进化树显示6株Ⅱ型C.acnes菌株的可能与痤疮发生有关。通过矩阵的聚类分析,发现C.acnes各个亚型在附属基因层面有较大差异。对50个菌株的基因组进行比对,筛选可能与痤疮发生相关(p0.05)的基因,共发现90个基因,只存在于可能致病的六株Ⅱ亚型菌株中,其中b_02220和b_00131两个基因可能为Ⅱ亚型的毒力因子基因。C.acnes获得红霉素耐药抗性的主要方式是Tn5432转座子介导的ermX基因水平转移。结论:1.C.acnes基因组高度保守;C.acnes核心基因SNPs位点可用于分析C.acnes菌株来源;C.acnes泛基因组进化树能更好的反应菌株基因组间差异。2.健康人来源和痤疮病人来源的两组C.acnes菌株,各有不同百分占比的基因参与了碳水化合物代谢和维生素合成。3.C.acnes的各个亚型均有自己的独有基因,且这些基因在功能上有着显著不同。4.在中国人群中,C.acnes的Ⅱ亚型菌株是寻常痤疮的主要致病亚型。5.b_02220和b_00131两个基因为C.acnes的Ⅱ亚型菌株的潜在毒力因子。6.携带ermX基因的Tn5432转座系统介导是C.acnes菌株获得红霉素耐药性的主要原因。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R758.733

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