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《中国医科大学》 2003年
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PI3K/PKB介导的bFGF对细胞生长的影响

于卉影  
【摘要】: 目的 成纤维细胞生长因子是一族对多种细胞的增殖、分化以及功能具有强烈调节作用的多肽,其中碱性成纤维细胞生长因子(basic FGF,bFGF)最为引人注目。很多起源于中胚层及神经外胚层的器官、组织都能大量地表达bFGF。bFGF广泛地影响着三个胚层来源的细胞。在病理条件下,由于它能强烈地促进血管生成并调节细胞功能,因而在肿瘤的发生、转移与脏器损伤后的修复中倍受关注。bFGF与其高亲和力受体结合后启动了信号传导过程,它包括FGF受体发生二聚体化,内源性酪氨酸激酶活化,受体内酪氨酸残基磷酸化以及胞浆内一系列后续信号传导蛋白的磷酸化与去磷酸化改变,直至将逐级放大的信号传入细胞核内。 关于FGF的细胞内信号转导通路的研究,是近年来细胞信号转导研究的热点,FGF在细胞内可通过多条转导通路发挥调节作用,如PLC/PKC,PTK/RAS/MAPK,PI3K/PKB,JAK/STAT等途径。PI3K/PKB是近年来发现的一个新的生长因子信号转导途径,主要通过生长因子与受体结合而激活,如PDGF,IGF,Insulin,EGF,VEGF等。RTK接受刺激以后,形成二聚体,发生自身酪氨酸磷酸化,与SH2区高亲和位点暴露,进而结合PI3K的p85亚单位,由RTK磷酸化p110亚单位而活化PI3K。蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)是PI3K的一个重要的下游调节激酶,它可以通过PI3K生成的脂类与PKB的PH区域结合,然后被由这些脂类调控的激酶磷酸化而活化,也可以通过不依赖PI3K途径被激活。大量研究证实,PKB与细胞代谢、生长、凋亡、恶变等密切相关,是机体维持正常生命活动的一个重要调节因子。 参与细胞周期调控的分子包括周期素(cyclin),周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)和周期素依赖性激酶抑制剂(cyclin-de-pendent kinase inhibitor,CKI)。在细胞周期进程中,周期素是调节细胞周期活动的重要蛋白,每种CDK的活化都依赖于细胞周期不同期相内细胞周期蛋白的表达,一些周期蛋白进入细胞周期调控反馈环路中参与调节其它周 期蛋白的转录。周期素表达量随细胞周期各个时相的转换而改变,提示周 期素的表达可用于判断细胞增殖活性。CKI这类抑制蛋白可以与CDK,Cy elm或Cyclin-CDK复合物结合而抑制它们的活性。CM在介导胞外信号 的转导中起重要作用,决定细胞周期继续进行下去,或细胞退出周期而分 化,或发生凋亡。p广一是目前已知的具有广泛激酶抑制活性的细胞周期 抑制蛋白,它通过依赖和非依赖M3途径,对细胞内信号和细胞外信号均能 作出反应,参与细胞生长、发育、分化、衰老及DNA损伤修复等多种功能的 调节。我们采用外源性 bFGF直接作用于 HEK293和 Bel-740细胞系,观 察不同浓度和不同作用时间bFGF对细胞胞膜、胞浆PKB活性的影响,对 P21”“和 crch a表达及细胞增殖的影响,以探讨wcr调控细胞周期进程 的可能信号转导机制。 方 法 1.*-”Pj ATP掺人法测定 PKB活性。 2.蛋白质印迹技术检测昨W和cyclin A表达。 3.RT-PCR技术检测的””znRNA和 Cyclin A mRNA表达。 4.流式细胞术分析细胞周期。 结 果 l.以75ng/Inl b血与yK293细胞共同孵育不同时间,发现胞膜和胞 浆PKB比活性在bFGF作用10ndn时升高最明显,为对照组的3.65倍和3. 39倍P<o.05人b见处理组与对照组膜、浆PK B比活性之间均存在显 著差异(P<o.05人以25吟d*FGF与*d-7狈2细胞共同孵育不同时 间,发现胞膜和胞浆的PKB比活性在bFGF作用10tnin时升高最明显,为对 照组的2.53倍和2.78倍瞩<o.05入b规处理组与对照组的膜,浆PKB 比活性之间存在显著差异(P<o.05人上述结果表明b卵作用HE K- 293细胞和Bel一7402细胞后,能迅速激活PKB活性,而且较低浓度b叮F 就能激活.Bel—7402细胞的 PKB活性。采用 PI3 K特异性抑制剂 wortlllan- nin预处理细胞lh后,再给予bFGF处理,结果发现经a预处理 ·2· 后,HEK293细胞和Bel一7402细胞膜、浆PKB比活性与未经预处理的各时 间组相比均下降,且差异显著门<o.05人表明M切对细胞2用的活化是 通过PI3K途径实现的。 2.75nlnlml bFGF处理HE删3细胞6h后,p1…蛋白表达达高峰,是 对照组的7.28倍(P<o.05)。25n矿d57群处理h-7地细胞Zh 后, p21倒蛋白表达达高峰,是对照组的9.啊倍(P<o.05人PI3 K抑制剂 wortlnalnnn不能阻断此诱导作用。75ng/ml bFGF处理HEK293细胞 16h 后,cyclin A蛋白表达达高峰,是对照组的L 50倍(P<0.05人 25ngilnl bF- GF处理Bd-7见细胞12h后,cyclin A蛋白表达达高峰,是对照组的9.10 倍瞩J.05入PI3 K抑制剂wo山地mdn能阻断此诱导作用河北.05人 3.RT-PCR分析显示人FGF能诱导HEK293细胞和Bel-7402细胞的 pZI…mmA表达,PI3K抑制剂wortmannin不能阻断此诱导作用。75ngl rnl bFGF处理HEK293细胞Zh后,昨1W”InRNA表达达高峰,是对照组的 3.的倍(P<o.肪)。25 n砂d b对肝处理*d-7她细胞lh 后,昨
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R329

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