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《中国医科大学》 2003年
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胶原蛋白和骨架蛋白及钠/氢交换抑制剂对糖尿病心肌病变的研究

吴伟  
【摘要】: 目的 研究糖尿病大鼠不同病程心肌胶原蛋白和骨架蛋白含量的变化,阐明两者对糖尿病心肌病变发生的作用以及研究钠/氢交换抑制剂对糖尿病心肌细胞钙超载的影响。 方法 1.制造糖尿病大鼠心肌模型:体重250-300gSpraque-Dawley(SD)大鼠36只,其中18只健康大鼠。18只经腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ,Sigma公司)60mg·Kg~(-1),7天后测定血糖≥16.7mmol/L为糖尿病大鼠。随机分为六组:糖尿病大鼠1个月组(DM1)、糖尿病大鼠3个月组(DM3)、糖尿病大鼠6个月组(DM6)和健康大鼠1个月组(C1)、健康大鼠3个月组(C3)、健康大鼠6个月组(C6)。每组大鼠各6只随机筛选入实验。各组分别于糖尿病大鼠模型成功后1个月、3个月和6个月进行腹腔内注射1.5%戊巴比妥(5mg·Kg~(-1))进行麻醉后,打开胸腔,摘取心脏,切取左心室4mm厚组织两块,将一份标本立即放入冻存管中,放入液氮中保存,待测心肌羟氨酸含量;一份标本4℃10%福尔马林固定24h,PBS冲洗,进行石蜡包埋,待测心肌细胞内胶原蛋白和转化生长因子β_1(TGF-β_1)及肌动蛋白含量。 2.测定心肌胶原总含量:以心肌羟氨酸水平来代表心肌胶原总含量。以氯胺T法测定羟脯氨酸含量。称取冰冻左心室心肌组织100mg,网搓匀浆后将组织粉末置于6M的HCL液2ml中125℃酸解5h,然后用6M的NaOH液滴定至pH为7,然后2000r.min~(-1)离心10min,取上清液1ml加柠檬酸缓冲液0.5ml,再加0.05M氯胺T 1ml,混匀氧化6min;然后加3.15M的过氯酸1ml,混匀放置5min;再加10%对二氨苯甲醛1ml80℃水浴6min,取出后冰水浴30min;最后一步UV-1206型分光光度计560nm处比色测定。同时用1μg~10μg的羟脯氨酸标准品按上述相同步骤制作标准曲线。对照标准曲线,求得羟脯氨酸含量,然后换算成每克心肌组织中羟脯氨酸含量,再乘以7.46即得心肌胶原总含量。 3.心肌免疫组织化学染色:用于Collagenl、Collagen 111、TGF一p:和 心肌型a肌动蛋白(a一actin)检测。采用石蜡切片,切片厚6林m抗原染色 如下程序:(l)载玻片防脱片剂处理:选用Poly一场sine。捞片后置烤箱 60℃30 min以使切片紧密粘附。(2)切片常规脱蜡至水。(3)蒸馏水新鲜 配置3%HZO:,室温5 min一1 0 min以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。(4) 热修复抗原:将切片浸人0 .olM构椽酸盐缓冲液(PH6.0),电炉或微波炉 加热至沸腾后断电,间隔5 min一10而n后,反复l一2次。冷却后PBS洗涤 1一2次。(5)滴加正常羊血清封闭液,室温20而n。甩去多余液体,不洗。 (6)滴加l:100稀释一抗(小鼠或兔IgG),4℃过夜。PBS洗2分钟x3次。 (7)滴加生物素化兔抗小鼠I步,20℃一37℃20而n。PBS洗2而n x3次。 (8)滴加试剂SABC,20℃一37℃20 min。PBS洗5而n x4次。(9)DAB显 色:使用DAB显色试剂盒。取ld蒸馏水,加试剂盒中A,B,C试剂各1 滴,混解剖学后加至切片。室温显色,镜下控制反应时间,约在30而n。蒸 馏水洗涤。(10)苏木素轻度复染。脱水,透明,封片。显微镜观察。 4.采用显微图象分析仪(MetaMorp丫DP10/BX51型)进行Coilagenl、 Conagen nl、TGF一p;和心肌型a一actin蛋白积分光密度分析,每组大鼠随 机取10一40个400倍显微镜视野图象,计算平均积分光密度(inter目卫ted optical density,IOD)。 5.光镜标本的制备:石蜡包埋心肌标本切片,切片厚4卿,做心肌胶 原MASSON染色。显微镜下观察心肌胶原分布。 6.透射电镜标本的制备:心肌标本用饿酸固定,PBS洗5而n x4,酒精 梯度脱水(30%、50%、70%),丙酮梯度脱水(80%、90%、100%)。环氧树 脂浸透包埋,温箱聚合,超薄切片(70nm),透射电镜观察、摄片。 7.糖尿病鼠心肌细胞的培养:出生5天体重l飞一22gspra四e一Dawley (SD)系鼠100只,经腹腔注射链脉佐菌素(streptozotocin,S犯,519口a公司) 60mg·Kg一’,7天后测定血糖〕16.7~心L为糖尿病鼠,2周内存活18只 用于实验。实验动物空腹状态下,测定血糖)16.7~FL,进行腹腔内注 射1.5%戊巴比妥(smg·Kg一‘)进行麻醉,然后打开胸腔,在无菌条件下, 摘取心脏,取出糖尿病鼠的心尖部组织,切成约(1一2)恤3大小的碎块,用 0.125%胰蛋白酶溶液分次消化,离心,将收集到的心肌细胞用含巧%胎牛 血清的DMEM培养基重新悬浮(含青霉素,链霉素,pH7.4),置于37℃、含 有5%C02的细胞培养箱内孵育90 min,进行差速贴壁,以除去非心肌细胞, 接种于50ml的一次性培养瓶中,每瓶细胞数要求达到(6一8) x 106个,在 二氧化碳培养箱中培养(37℃,95%空气+5%二氧化碳),每2一3d更换一 次培养基,取培养4d的单层细胞进行实验。 8.FR损伤模型的制备及分组:取瓶底覆盖有单层心肌细胞的培养瓶 若干瓶分为四组:(l)糖尿病单纯缺氧组(DM组),在培养瓶中加人用混合 氮气(95%氮气+5%二氧化碳)饱和30min的台氏(介功de’s)液(不含糖) 2ml(PO:蕊0.67kPa),同时向瓶中充人混合氮气以置换瓶中剩余的空气,封 闭瓶口密闭180min,形成缺氧模型。复氧期则换用混合空气(95%空气+ 5%二氧化碳)饱和的含15%胎牛血清的DMEMZml(POZ在17.33一20. ookPa之间),并持续向
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