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结合珠蛋白在正常及病损皮肤中的表达

李萍  
【摘要】: 目的 1.探讨在正常及炎症刺激后,结合珠蛋白(haptoglobin,Hp)mRNA在小鼠表皮、真皮、表真皮组织中的表达情况,并采用原位杂交方法进行定位观察,以确定Hp mRNA在皮肤中的表达位置及其与炎症的关系。 2.在mRNA水平探讨正常人皮肤中Hp的表达,以进一步观察Hp mRNA在皮肤中表达的确切位置及其在不同部位皮肤中的表达差异;在蛋白质水平上研究Hp在正常人皮肤中的表达情况。 3.探讨Hp mRNA在银屑病患者皮损及皮损周边外观正常皮肤、扁平苔藓、红皮病、脂溢性角化病、寻常疣、基底细胞上皮瘤、鳞癌、系统性红斑狼疮患者皮损及曝光部位正常皮肤、天疱疮、大疱性类天疱疮患者皮损中的表达,进一步确定Hp mRNA在皮肤中的表达位置及在不同皮肤病中表达的差异;并在蛋白质水平观察Hp在上述皮损中的表达情况。 材料和方法 1.标本收集 1.1实验动物 C57BL/6小鼠20只,分为生理盐水组和细菌脂多糖(LPS)刺激组,每组10只。均为雌性,2~4月龄。分别获取表皮、真皮和表真皮组织。 1.2正常人皮肤 30例正常成人皮肤来自外科手术患者,男19例,女11例。其中头皮2例,面部6例,躯干部13例,四肢9例。取材部位无肿瘤及炎症性皮肤病损害,所取皮肤组织均去除皮下脂肪组织。 1.3皮肤病患者皮损 寻常型银屑病22例,其中进展期14例,稳定期8例,同时取16例患者的皮损周边外观正常皮肤;扁平苔藓16例;红皮病8例(2例由蕈样肉芽肿诱发,3例由银屑病诱发,3例由湿疹诱发);脂溢性角化病15例;寻常疣10例;基底细胞上皮瘤10例;鳞癌10例;系统性红斑狼疮12例,同时取10例患者的曝光部位正常皮肤;天疱疮10例,其中寻常型7例,红斑型3例;大 疮性类天疮疮10例。以上患者均经临床、组织病理及免疫病理学等检查确 定诊断。 2.实验方法 2.l半定量RT-PCR 2.豆.l小鼠组织总RNA的提取 所取组织制成匀浆后,用异硫氰酸狐-酚-氯仿一步法提取总RNA。 2.1.2总RNA浓度、纯度和完整性测定 用紫外分光光度仪测定RNA在260urn和280run处的光密度值,以确 定 RNA的浓度和纯度。用 1.5%甲醛琼脂糖凝胶电泳证实 RNA的完整 性。 2.1.3对小鼠组织所提取的RNA进行RT—PCR检测 分别按照要求制备反应体系并在特定条件下完成反转录及PCR反应, 每一个标本均分别用HP和内对照p-actin引物对进行PCR扩增。HP特 异性扩增片段长度为475hP,P-actin特异性扩增片段长度为54O hP。 2.2原位杂交法检测 2.2.l所有小鼠表真皮、正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均按 照要求在-25℃恒冷切片机上制备12pm厚的切片。 LL二采用小鼠及人Hp原位杂交检测试剂盒进行检测。针对小鼠及 人 Hp的 CDNA探针序列如下:5’-AGTGC TCCAC ATAGC CA’I’GT GCAAT CTCGG—3’,5’一 CCTGC CAGGG AAAGC TGCCT ITGGC ATCCA-3’,5’ 一 CATAC CAGGT GTCCT CCTCC AGGTC GTGAA—3’。 2.2.3对照的设立:阳性对照为小鼠肝组织;阴性对照为同一标本的切 片省略生物素化鼠抗地高辛或省略探针。 2.3免疫组织化学[链霉卵白素标记的亲合素、生物素(LAB-SA) 法厂染色 对所有正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均用抗-地单克隆抗 体、生物素标记的羊抗小鼠IgG及辣根酶标记的链霉卵白素进行检测。 2.4免疫荧光双标记检测 对所有正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均用抗-Hp单克隆抗 体、罗丹明标记的羊抗鼠哪和FITC标记的CDla单克隆抗体进行检测。 3.结果判断标准 ·2· 3.IPCR产物的检测 扩增产物在*5%琼脂糖凝胶中电泳,紫外凝胶成像系统上照相。电 泳结果采用 Flo毗hem V 2.0凝胶成像分析软件(AInerica)分析,记录每条 DNA扩增带的灰度值,将每一个目的DNA扩增片段的灰度值与相应的内 对照p-achn扩增片段的灰度值的比值(e/c)作为每一个目的基因InRNA 的半定量指标。 3.2原位杂交结果 细胞浆染成桔红色为阳性,结果用 Meta Morph Im哈ng System软件处 理,按图象灰度结果分为五个等级:无染色,灰度值不少于 130,为阴性 (-入轻微染色,灰度值在125-130之间,为弱阳性(。*染色较浅,灰度 值在115刁 之间,为阳性(+*染色较深,灰度值在105* 之间,为较 强阳性(++八染色深,灰度值不大于105,为强阳性(+++八 3.3免疫组化阳性细胞计数 每个标本至少对三张连续切片进行计数,阳性树突状细胞以同时见到 胞体和树突来确定。阳性树突状细胞的密度采用:线性密度=阳性细胞剃 nun(表皮长度)和(或)阳性细胞数/rum\表皮面积* 400倍显微镜下随机 选取20个连续视野进行计数)来表示。 3.4免疫荧光双标记结果 呈现树突状结构并发出红色荧光为HP表达阳性的细胞;呈现树突状 结构并发出亮绿色荧光为CDla丫 朗格汉斯细胞。 4.统计学处理: 4.l两组小鼠表皮和表真皮组织


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