结合珠蛋白在正常及病损皮肤中的表达

【摘要】： 目的 1．探讨在正常及炎症刺激后，结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)mRNA在小鼠表皮、真皮、表真皮组织中的表达情况，并采用原位杂交方法进行定位观察，以确定Hp mRNA在皮肤中的表达位置及其与炎症的关系。 2．在mRNA水平探讨正常人皮肤中Hp的表达，以进一步观察Hp mRNA在皮肤中表达的确切位置及其在不同部位皮肤中的表达差异；在蛋白质水平上研究Hp在正常人皮肤中的表达情况。 3．探讨Hp mRNA在银屑病患者皮损及皮损周边外观正常皮肤、扁平苔藓、红皮病、脂溢性角化病、寻常疣、基底细胞上皮瘤、鳞癌、系统性红斑狼疮患者皮损及曝光部位正常皮肤、天疱疮、大疱性类天疱疮患者皮损中的表达，进一步确定Hp mRNA在皮肤中的表达位置及在不同皮肤病中表达的差异；并在蛋白质水平观察Hp在上述皮损中的表达情况。 材料和方法 1．标本收集 1．1实验动物 C57BL／6小鼠20只，分为生理盐水组和细菌脂多糖(LPS)刺激组，每组10只。均为雌性，2～4月龄。分别获取表皮、真皮和表真皮组织。 1．2正常人皮肤 30例正常成人皮肤来自外科手术患者，男19例，女11例。其中头皮2例，面部6例，躯干部13例，四肢9例。取材部位无肿瘤及炎症性皮肤病损害，所取皮肤组织均去除皮下脂肪组织。 1．3皮肤病患者皮损 寻常型银屑病22例，其中进展期14例，稳定期8例，同时取16例患者的皮损周边外观正常皮肤；扁平苔藓16例；红皮病8例(2例由蕈样肉芽肿诱发，3例由银屑病诱发，3例由湿疹诱发)；脂溢性角化病15例；寻常疣10例；基底细胞上皮瘤10例；鳞癌10例；系统性红斑狼疮12例，同时取10例患者的曝光部位正常皮肤；天疱疮10例，其中寻常型7例，红斑型3例；大 疮性类天疮疮10例。以上患者均经临床、组织病理及免疫病理学等检查确 定诊断。 2．实验方法 2．l半定量RT－PCR 2．豆．l小鼠组织总RNA的提取 所取组织制成匀浆后，用异硫氰酸狐－酚－氯仿一步法提取总RNA。 2．1．2总RNA浓度、纯度和完整性测定 用紫外分光光度仪测定RNA在260urn和280run处的光密度值，以确 定 RNA的浓度和纯度。用 1．5％甲醛琼脂糖凝胶电泳证实 RNA的完整 性。 2．1．3对小鼠组织所提取的RNA进行RT—PCR检测 分别按照要求制备反应体系并在特定条件下完成反转录及PCR反应， 每一个标本均分别用HP和内对照p－actin引物对进行PCR扩增。HP特 异性扩增片段长度为475hP，P－actin特异性扩增片段长度为54O hP。 2．2原位杂交法检测 2．2．l所有小鼠表真皮、正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均按 照要求在－25℃恒冷切片机上制备12pm厚的切片。 LL二采用小鼠及人Hp原位杂交检测试剂盒进行检测。针对小鼠及 人 Hp的 CDNA探针序列如下：5’－AGTGC TCCAC ATAGC CA’I’GT GCAAT CTCGG—3’，5’一 CCTGC CAGGG AAAGC TGCCT ITGGC ATCCA－3’，5’ 一 CATAC CAGGT GTCCT CCTCC AGGTC GTGAA—3’。 2．2．3对照的设立：阳性对照为小鼠肝组织；阴性对照为同一标本的切 片省略生物素化鼠抗地高辛或省略探针。 2．3免疫组织化学［链霉卵白素标记的亲合素、生物素（LAB－SA） 法厂染色 对所有正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均用抗－地单克隆抗 体、生物素标记的羊抗小鼠IgG及辣根酶标记的链霉卵白素进行检测。 2．4免疫荧光双标记检测 对所有正常人皮肤组织和皮肤病患者皮损组织均用抗－Hp单克隆抗 体、罗丹明标记的羊抗鼠哪和FITC标记的CDla单克隆抗体进行检测。 3．结果判断标准 ·2· 3．IPCR产物的检测 扩增产物在＊5％琼脂糖凝胶中电泳，紫外凝胶成像系统上照相。电 泳结果采用 Flo毗hem V 2．0凝胶成像分析软件（AInerica）分析，记录每条 DNA扩增带的灰度值，将每一个目的DNA扩增片段的灰度值与相应的内 对照p－achn扩增片段的灰度值的比值（e／c）作为每一个目的基因InRNA 的半定量指标。 3．2原位杂交结果 细胞浆染成桔红色为阳性，结果用 Meta Morph Im哈ng System软件处 理，按图象灰度结果分为五个等级：无染色，灰度值不少于 130，为阴性 （－入轻微染色，灰度值在125－130之间，为弱阳性（。＊染色较浅，灰度 值在115刁 之间，为阳性（＋＊染色较深，灰度值在105＊ 之间，为较 强阳性（＋＋八染色深，灰度值不大于105，为强阳性（＋＋＋八 3．3免疫组化阳性细胞计数 每个标本至少对三张连续切片进行计数，阳性树突状细胞以同时见到 胞体和树突来确定。阳性树突状细胞的密度采用：线性密度＝阳性细胞剃 nun（表皮长度）和（或）阳性细胞数／rum＼表皮面积＊ 400倍显微镜下随机 选取20个连续视野进行计数）来表示。 3．4免疫荧光双标记结果 呈现树突状结构并发出红色荧光为HP表达阳性的细胞；呈现树突状 结构并发出亮绿色荧光为CDla丫 朗格汉斯细胞。 4．统计学处理： 4．l两组小鼠表皮和表真皮组织