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《中国医科大学》 2003年
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TrkA基因抑制神经母细胞瘤增殖和血管生成及诱导其分化的研究

张继红  
【摘要】: 目的 观察TrkA基因抑制神经母细胞瘤(NB)细胞增殖、诱导其分化及引起该细胞合成、分泌血管内皮生长因子(VEGF)下降情况;探讨TrkA基因通过抑制NB血管生成而阻止其生长、转移的可能性。 方法 1.将人NB SH-SY5Y(SY5Y)细胞复苏后常规培养,待细胞长至一定数目,将其分为三组:实验组,空载体组,对照组。2.利用脂质体转染法将pBPSTR1-TrkAcDNA重组质粒及pBPSTR1载体质粒分别转染入实验组和空载体组两组SY5Y细胞中。经0.5μg/ml嘌呤霉素筛选培养后的转化细胞系分别命名为SY5Y-TrkA及SY5Y-Vec细胞。3.分别提取两种转化细胞系及SY5Y母系细胞的总RNA,应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行TrkA基因片断的扩增。扩增片断长度523bp,内参照β-actin扩增片断长度700bp。4.三组细胞以相同条件、相同密度接种在24孔板及100毫升培养瓶中,一周后利用台盼兰拒染实验判断活细胞数,并且在相差显微镜下计数分化细胞,比较转染前后细胞的增殖速度及分化程度。5.利用RT-PCR技术检测三组细胞中VEGFmRNA的表达,扩增片断长度535bp,内参照β-actin扩增片断长度422bp。所有的RT-PCR产物皆用2%的琼脂糖凝胶电泳分析。6.免疫组化检测VEGF蛋白的表达:取三组细胞制成细胞悬液,浓度为1×10°/ml。将细胞悬液均匀滴到载玻片上,戊二醛固定后进行免疫组化染色。细胞浆被染成棕黄色则视为染色阳性,实验结果以染色强度和阳性细胞百分率的得分之和进行评估。7.细胞培养上清中VEGF含量的测定:三组细胞同一条件下无血清培养液培养24小时,收获培养上清;离心后将上清液进行ELISA试验检测VEGF含量。8.瘤细胞在裸鼠皮下致瘤:三组裸鼠分别注射三组细胞悬液,浓度为(2.5×10~7个/ml/只)。接种后观察肿瘤生长情况,50天后,处死动物,取肿瘤标本 进行检测比较。9.RT-PCR检测肿瘤标本中VEGFmRNA表达;免疫组化 检测VECF蛋白表达。ic.肿瘤标本的MVD测定:苏木素伊红(HE)染色 石腊切片,数字图像分析系统计算每组血管面积。*.数据处理:实验结果 以均数上标准差(X i SD)表示,两均数比较采用 t检验。 结 果 1.成功转染TrkA基因并在SYSY细胞中稳定表达,转染后SYSY细胞 的增殖率较亲代细胞明显下降h<0.00入细胞的分化程度增加h<0. 001)。2.SYSY-TrkA细胞中的 VEGF mRNA(P<0.of)及蛋白表达(P< 0.co间较亲代S%Y细胞明显下降;细胞培养上清液中的VEGF含量也明 显下降h<0.00人3.SYSY-TrkA细胞在裸鼠皮下的致瘤性和其所致 肿瘤的血管生成能力明显下降。实验组与对照组及空载体组相比,肿瘤体 积缩小(p<0.01);VEGF的表达差别显著(p<0.of);MVD差别显著(p< 0.of)。 结 论 1.TrkA基因的高表达能有效抑制神经母细胞瘤的生长,并能促其分 化成熟;Ts的信号通路在NB的生长分化中起着重要的作用。 LTs基因的高表达能有效抑制NB细胞合成分泌血管内皮生长因 子。 3.TrkA基因能降低NB细胞的致瘤性及抑制神经母细胞瘤的血管生 成和肿瘤生长。为应用该基因行抗血管治疗神经母细胞瘤触理论依据。
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R739.4

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