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《中国医科大学》 2003年
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HIV-1生物学特性及宿主遗传背景与疾病进展关系的研究

孙峥嵘  
【摘要】: 前言 艾滋病,即获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)引起的一种免疫缺陷性疾病。人体感染HIV后,致使机体免疫功能逐渐降低,最后因各种机会性感染而死亡。HIV感染流行难以控制的主要原因是其基因具有高度变异性,目前HIV感染/AIDS尚无法治愈,也无有效的疫苗预防。截止到2002年底全世界HIV感染人数已达6000万,已有2400万人死于艾滋病。到2002年12月我国HIV感染人数已超过100万,正处于艾滋病快速增长期。因此,有效地预防和治疗艾滋病已成为当务之急。 人体感染了HIV以后数年至数十年内可出现持续性CD4细胞数下降,最终导致免疫缺陷,出现艾滋病的各种临床症状。在疾病进展过程中,不同个体CD4细胞数的下降速率相差很大。研究表明,在发病和病情变化的过程中,病毒的变异和宿主因素是决定病程进展的关键因素。目前在研究AIDS疾病进展时,只选择CD4+细胞计数及病毒载量这两个评价指标,但由于HIV-1具有高度的变异性,在全球不同地区流行株的分离及其生物学特性的研究都具有十分重要的意义。国外许多研究表明HIV-1生物学特性是决定病程进展的关键因素,其中HIV-1细胞嗜性及准种的变化直接反映病毒的细胞趋向性、变异频率以及复制能力,清楚地显示了在体内的HIV-1对疾病进展的影响,故目前有关HIV-1感染人体后疾病进程中细胞嗜性、准种的变化受到人们越来越多的关注。 大量数据表明,对于HIV感染的敏感性及在进展到AIDS的过程中宿主的遗传背景是一个重要的决定因素。人类白细胞抗原(Human leukocyte antigen,HLA)是人类主要的遗传标志,具有高度多态性,其多态性的差异决定个体免疫应答的不同。艾滋病经性接触和血液等途径传播,但并不是所 有暴露于HIV的人都被HIV感染,感染者的疾病进程也有着明显的个体差 异。国外研究表明,对于 HIV易感性及 AIDS的疾病进展情况,宿主的 HLA 特性是一个重要因素,在抗HIV感染中发挥重要作用。具有细胞毒性T淋 巴细胞* T lymPhocyte,CTL)活性的 CDS+T淋巴细胞通常与 HLA I类分子抗原决定簇反应后发挥作用,在HIV感染中CTL功能是免疫重建 的重要指标。 本文通过微量全血分离法分离17株HIV一病毒并研究其生物学嗜 性、复制动力随疾病进展的变化,应用异源双链泳动分析(Heteroduplex mobility assay,HMA)的方法研究48例 HIV-l准种的变化与疾病进展的 相关性,采用聚合酶链式反应一序列特异性引物技术kolymerase chain re- “”t’“”-SPednc sequence Primers,PCR一SSP)检测46例中国 HIV感染者及 AIDS患者HLA-A在八位点等位基因特异性,探讨HIV感染与HLA的相 关性。 材料与方法 二.研究对象 HIV/AIDS病例全部由中国医科大学附属一院艾滋病确认实验室经 WB试验确认为HIV感染阳性。传播途径包括静脉吸毒、性传播及输血等 方式。所有标本均在未接受抗病毒治疗以前采集。根据《中华人民共和国 HIV/AIDS诊断标准补CD4+T细胞数3200个/ul判断为无症状HIV感染 期;CD4+T细胞数<200什ul判断为 AIDS期。 2.26例HIV/AIDS病毒分离 应用微量全血分离法从26例HIV/AIDS病例中分离得到17株HIV一二 病毒,并将分离得到的病毒株增殖,测定其半数组织细胞感染量(Tissue cell InfeCtioll dose 50助,TCID50)。 3.HIVJ病毒感染细胞及病毒嗜性分析 将 HIV叫病毒株以 100TCID50分别感染置于 24孔板培养的浓度为 5 X 10勺Inl的巨噬细胞、浓度为2 X 10Vrnl MT-2细胞,并洗掉未感染细胞的 病毒。以培养上清液中的P24抗原做为病毒生长的评价指标,每3天进行 一次 P24抗原的检测,直至 15天,观察其在巨噬细胞、MT-2细胞的细胞融 ·2· 合及病毒增殖情况。 4.HIV人病毒复制动力学的检测 将*V入病毒株以 100TCID50感染预刺激浓度为 IX 10Vml PBMC 细胞,并洗掉未感染细胞的病毒。以培养上清液中的厂排抗原做为病毒复 制动力学的评价指标,每3-4天换培养液一次,每7天换一次预刺激的 PBMC,每3天进行一次P24抗原的检测并观察CPE,直至15天。 5.PCR扩增 HIV一lenv夕膜基因 V3-VS区 PCR ()DNA提取:外周抗凝静脉血快速提取全基因组DNA采用PURE- GENE试剂盒,将水合后的DNA置一20℃保存备用。 (2)PCR扩增HIV—lenv外膜基因V3-VS区PCR及前病毒DNA定 量:采用套式 PCR(Nest-PCR,N-PCR)方法扩增 HIV-lenv夕膜 V3-VS 区基因,以EDS/ED12为外侧扩增引物进行第一轮PCR反应;取sgl PCR 产物,以 ES7/ESS为内侧引物进行第二轮PCR,片段大小为702hp,其中靶 片段为 627bg。HIV一二前病毒拷贝的半定量 PCR是将全基因组的 fun **A做系列倍比稀释*.2、o.05、o.02、o.皿5、o.肋ZUg,然后做N-PC R。 一个阳性 NPCR标志着至少一个 HIV一旦前病毒的存在,从而估计出二卜召 全基因组 nwx所含前病
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R373

【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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【共引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前7条
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