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《中国医科大学》 2003年
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实验性脑损伤的分子病理学研究:MAP-2、COX-2、GDNF、Caspase-3反应性表达的时间规律性

吴旭  
【摘要】: 目的 脑是人体的中枢生命器官,也是暴力损伤中极易受累的器官。颅脑损伤的发生率及重型颅脑损伤病人的死残率均甚高。作为法医工作者,关心的方面在于影响脑损伤种类、损伤程度的因素,如机械性暴力的大小、作用方向、作用次数、致伤物的性状、受伤时的体位及运动状态、损伤部位,以及脑损伤后的改变,如脑缺血缺氧、脑水肿、颅内压的变化等。其中损伤后脑组织各种指标的改变与损伤形成时间、损伤程度的关系一直是法医工作者潜心研究的重要课题。 本实验从自行设计大鼠脑损伤落体打击器开始,先行建立了一个便于观察和施加处理因素、控制性好、重复性好的动物模型,选用30g击锤从25cm高处下落,冲击应力σd为355.09Kpa,打击大鼠右顶部,造成中等程度的闭合性脑损伤,从病理形态学、组织超微结构观察及微管相关蛋白-2(microtubule associated protein 2,MAP-2)、环氧合酶-2(cyclooxygenase 2,COX-2)、胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neutrophic factor,GDNF)、Caspase-3基因及蛋白表达的时间性变化,详尽系统地阐述脑损伤后各指标变化的时间规律性及表达差异可能的形成机制。并通过上述指标分别与神经元特异性标志物神经元核蛋白(neuronal nuclear protein,NeuN)和星形胶质细胞特异标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)进行免疫组织化学双染色,探讨脑损伤后神经元及神经胶质细胞反应性变化情况及其分子生物学机制,以期为脑损伤研究提供有益的数据材料,也为以上指标在法医学实际检案的应用提供必需理论依据。 方法 1.大鼠脑损伤落体打击器的设计 本研究设计研制了一个大鼠脑损伤落体打击模型,打击装置由外周导 管、打击器固定架、击锤(底部为撞杆)三部分组成,均为不锈钢材料。外周 导管长45 cm,外径1.gcm,内径1.scm,保持每隔* 有一气孔,以防击锤 下落时导管内空气阻力的影响。导管下端用一个可旋转、拆卸的螺扣封闭, 螺扣内径为 1.9 cm。外周导管以两个可移动导管架与打击器固定架相连, 与水平面垂直。打击器固定架顶端有两个定滑轮,牵拉击锤上端丝线通过 两个定滑轮,可将击锤提起,实验时根据需要在不同高度放开丝线,使击锤 落下。击锤重”,击锤底部为撞杆,击锤直径*3cm,撞杆直径为4nun,撞 杆头端可超过导管下端封闭螺扣2.smm。固定装置由硬水底座、打击器固 定架、动物头部固定器组成,硬木底座同时用作动物台。进行打击时,可将 动物俯卧位置于硬木底座上,底座两侧各有四个动物四肢固定器,可根据动 物的大小调整固定位置。动物头部固定器分左右两个,安装在底座上,可前 后移动,每侧又各有一个可上下活动的钝头螺栓,可在合适位置固定大鼠头 部。本实验选用叨 击锤从25cm高处下落,冲击应力d为355.09KPa,造 成中度脑损伤,并在伤后不同时间取材,进行形态学观察。 2.实验动物分组和动物模型制作 随机选择成年健康 SPpe-Dawley雄性大鼠,体重 150-2509,正常对 照组4只,假手术组4只,伤后分14组,分别为15、30ndn,l上在*2h,\上、 3上5、7、1530d组,每组5只,共计78只。大鼠称重后,按二班y一剂量用 3%的成巴比妥钠腹腔内注射麻醉,以309重锤从25cm高处下落打击,致 中度脑损伤。在伤后规定时间灌流固定。 3.HE染色 4.电镜超薄切片制作 5.免疫组织化学染色 6.免疫组织化学双重染色 7.原位杂交染色 8.Wstem Blotting 9.图像分析与统计学处理 应用 Metamoroh Imsae System(UIC,美国)/DP 10/Olympus BX 51 (日本)显微摄影图像分析系统,用400倍显微镜,在损伤灶周围随机选5 个视野,对 MAP-2人一2下DNF人aspase-3免疫组织化学染色、原位杂 交染色阳性反应物进行定量检测,测定阳性反应物平均灰度,然后在SPSS ·2· 10.0 for Wndows软件下进行统计学处理。 应用上海天能公司 GIS-700D凝胶图像分析系统对Western Blotting 后蛋白杂交条带进行扫描,并用脚与正常对照组密度之比,即相对密度值 进行定量分析。 结 果 脑损伤的病理形态学观察多时间段均可见损伤程度近似的大脑皮质挫 伤灶,挫伤中心可见脑组织坏死、出血,另外各时间段均可见不同程度的蛛 网膜下腔出血,损伤lh内,损伤灶周围神经无形态变化不大,伤后12h出现 神经元胞体呈三角形,核仁不清,核深染,胞体嗜伊红性增强,轴突肿胀,尼 氏体溶解消失等神经元缺氧性改变;伤后id,神经元改变依然存在,但神经 胶质细胞反应随时间延长逐渐增强,表现胶质结节形成、卫星现象和噬神经 现象等改变更加明显;伤后3d,格子细胞即有出现。伤后id,挫伤出血区细 胞形态不规则,有血红蛋白析出;伤后3d,挫伤出血区可见巨噬细胞吞噬红 细胞;到伤后15d,巨噬细胞内可见含铁血黄素颗粒。 电镜超微结构改变伤后lh即可见神经细胞内线粒体肿大,部分峙溶 解;伤后3h则有线
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:D919

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