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《中国医科大学》 2002年
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氟致大鼠肝、肾细胞损伤机制及抗氧化营养素的干预性研究

贾丽红  
【摘要】: 前言 氟中毒是严重危害人体健康的主要地方病之一。我国是地方性氟中毒的重度流行国家,目前受累人数达1亿多。有关氟中毒的病理机制尚不十分清楚,对氟中毒病人也缺乏有效的治疗药物。因此有关氟中毒病理机制的研究以及拮抗过量氟对机体损伤因素的研究就显得十分必要。 地方性氟中毒是由于人们长期生活在高氟环境或生活习惯摄入过量氟而引起的慢性蓄积性中毒,以牙齿、骨骼等硬组织损伤最为明显。近年来,随着对氟中毒的深入研究,地方性氟中毒的非骨相损害越来越引起国内外学者的关注。地方性氟中毒(地氟病)的病理机制十分复杂,目前尚无一致的解释。最近有学者指出地氟病的发病机制主要有以下三方面学说:1)低营养低钙学说,2)自由基学说,3)镁学说。 近年来,随着自由基学说理论的研究深入,在谈到氟中毒的非骨相损害时,人们常认为与自由基、氧化应激有关。大量动物实验的结果也提出氟可致大鼠或小鼠脂质过氧化作用增强,机体MDA含量增高,抗氧化酶(SOD,GSH-Px,CAT)活性降低;并且补充外源性抗氧化营养素(Se,Vc,VE,GSH,β-Carotene)可以不同程度的拮抗或降低氟引起的过氧化反应。但也有一些研究结果与之相反。如氟骨症患者全血Cu,Zn-SOD活性明显高于正常对照组;小鼠短期摄入较低剂量氟可增强抗氧化作用。在国外,Saralakumari等检测印度慢性氟中毒患者,发现其血中GSH含量明显增加,并伴有红细胞GSH-Px等活力升高,认为这是红细胞对抗氧化应激的一种方式。这些互为矛盾的结果是由于实验条件(染毒剂量、时间、组织种类)与检测手段的不同,还是反映氟化物本身作用机制的多样性,现在还难以定论。 氟化物是否具有潜在致癌性仍然是目前氟健康效应研究的课题。许多研究证实氟可导致体外培养的哺乳细胞,包括人体细胞产生遗传物质损伤,微核及染色体畸变。但也有相反的结论。F对遗传物质损伤的机制尚不清楚。 以往研究主要采用氟中毒大鼠或氟中毒患者,研究氟对机体氧化与抗 氧化平衡的影响,同时给予单一或二种抗氧化剂,观察是否有抬抗氟的毒性 作用。众所周知,机体在许多情况下如饥饿、劳累、乏氧犬伤、吸烟以及营 养状况等均可影响氧化与抗氧化平衡,导致氧化应激作用增强,而氧化应激 又可引起机体多组织多器官的损伤。 Vc*卜3e和GSH都是体内重要的抗氧化营养素,但他们在发挥抗氧 化机制方面有所不同。因此,本实验以氟中毒非骨相损伤容易受累的组织 肝细胞和肾细胞为研究靶子,首先通过细胞增殖反应,直接研究氟对肝、肾 细胞造成的毒性作用,以确定氟的毒作用剂量;在此基础上,研究此毒作用 剂量下的氟对肝/肾细胞氧化与抗氧化平衡的影响及对DNA的损伤作用, 同时探讨不同抗氧化营养素对上述氟造成的细胞损伤是否有抬抗作用。为 进一步探讨氟中毒的发病机制,预防和治疗氟中毒的发生与发展提供科学 依据。 材料与方法 材料:NaF,NaZ SeO。,DL—a一生育酚(a-TocoPherol,E.Merck),H甲 基亚矾,还原型GSH(日本产品厂VC(东北制药总厂生产厂RPMI 1640培养 液卜igTna,含10%胎牛血清,100U/rnL青霉素,100P吵nL链霉素X胰蛋白 酶(DifcoL考马斯亮蓝G250,黄源吟,黄瞟吟氧化酶,Alamar Blue,低熔点 琼脂糖(华美公司人正常熔点琼脂糖,Titon X一 瞩igrna入 Tis(进口分 装厂水平电泳槽和电泳仪日京六一仪器厂厂 OlymPus BX60荧光显微镜 (日本),Nikon y-35A数码相机(日本)。 方法:采用组织块酶消化法,分离培养大鼠肝、肾细胞。选择生长繁殖 良好的细胞并分组如下。NaF组:加人不同浓度的NaF培养48h。抗氧化 营养素组:预先在肝、肾细胞培养液中加人一定剂量的 VcJD3e和 GSH作 用12h后,再加人不同浓度NaF共同培养36h。首先通过细胞增殖反应,确 定造成肝、肾细胞损伤的毒作用剂量;然后在此基础上研究氟对细胞氧化与 抗氧化能力的影响及对DNA的损伤作用同时探讨不同抗氧化营养素对氟 的干预作用。 指标测定: ·2· 二肝。肾细胞增殖率用 Alamar Bluem还原率表示。 2蛋白质测定采用考马斯亮蓝法。 3 MDA的测定:硫代巴比妥酸(TB)法,单位以 nmoUInl表示。 4 SOD活性的测定:亚硝酸盐法,以亚硝酸盐单位/每mg蛋白含量 (NU/mg.Pr)表示酶活性。 5 GSH-u活性测定:改良DTNB法,以U/mg.pr表示酶活性。 6细胞DNA损伤:采用单细胞凝胶电泳实验。 结 果 (一)NaF对大鼠肝、肾细胞增殖反应的影响及抗氧化营养素的干预作 用 1,当NaF的浓度分别为0.5 mmoUL和0.InunoUL时,对大鼠肝、肾细 胞增殖反应开始出现明显的抑制作用(P<O.05X并且随着NaF浓度的进 一步升高,对肝、肾细胞的抑制作用增强,肝细胞出现明显的剂量一效应关 系。 2.一定浓度的Vc*卜3e和GSH能桔抗0.5 rnmoUL的NaF对大鼠肝。 肾细胞增殖反应产生的抑制作用(P<o.05八但随着NaF浓度的升高,
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