WEB2基因在酿酒酵母S期检查点调控机制中的作用

【摘要】： 细胞周期各事件按正常时空顺序发生，才能确保遗传信息忠实传递及细胞正常分裂。细胞周期各事件存在一种相互依赖关系。检查点调控机制协调各事件的转换。正常细胞发生DNA损伤或是合成阻断时，将通过细胞周期检查点阻滞在特定的细胞周期内，并诱导某些特殊的转录反应，直到损伤修复后才恢复正常分裂。检查点通路的损伤，会增加基因的不稳定性，并且与肿瘤的发生密切相关。在哺乳动物中，已确定了某些检查点基因，如P53基因。但是，由于哺乳动物检查点调控是极为复杂的调控过程，目前很难弄清其机制。而酵母菌遗传构成相对简单且具代表性，目前仅美国几个课题组利用酵母模型来探讨检查点调控机制。并建立了一个初步的S期检查点调控模型，即pol2以某种方式感知DNA损伤，将信息传递给Mec1，其后活化Rad53，活化的Rad53再阻止细胞进行分裂。WEB2(Wants E1A badly2)基因是一个4500多碱基对的大基因，等同于Dna2基因，定位于酿酒酵母8号染色体右臂，目前已明确其编码产物具有3到5的DNA解链酶活性，在DNA复制中发挥作用。考虑到WEB2蛋白为一个17.5万dal的大蛋白分子，除了具有DNA解链酶功能外，还可能具有其他功能。本研究利用一个已获得的WEB2突变株，来探索WEB2基因是否参与酵母菌检查点通路，确定WEB2基因在检查点调控通路上的工作位点及与其他参与检查点的基因的相互关系，以加深对细胞检查点通路的了解，为研究肿瘤的发生机制提供线索。 第一部分 WEB2基因参与酿酒酵母S期检查点调控机制 本实验使用的WEB2突变株，WEB2基因上点突变，依赖所携带质粒的腺病毒E1A肿瘤基因表达来存活，但是E1A并不是替代WEB2基因的功能。根据该突变株对DNA合成阻断剂HU的敏感性，可以判断其是否丧失S期检查点调控功能，从而弄清楚WEB2基因是否工作在上述通路上。 当n批突变株和野生株一样经a因子处理sj小时后，由于d因子 可诱导Farl蛋白表达，Farl与CDC28结合，抑制其CDK活性，故细胞阻滞 在m期。将同步于0期的酵母细胞转人含有HU的YPG培养基，细胞摆 脱a因子的作用，开始进人S期进行DNA复制。但是油于HU阻断DNA 合成，所以正常的酿酒酵母细胞由于S期检查点的调控作用而阻滞于S期， 而WEBZ突变株却无法阻滞在S期，而是进人GZ／M期，并开始细胞分裂， 其表现为：流式细胞仪检测细胞DNA含量，WEBZ突变株同野生株一样 DNA并未倍增，DNA合成被有效阻断，未完成复制；间接免疫荧光染色纺锤 体显示，WEBZ突变株于HU处理3小时后，多数细胞纺锤体微管延长，呈 现酿酒酵母细胞正常分裂时的形态。而野生株细胞虽然生出大芽，但纺锤 体并不延长，未进行细胞分裂。这些结果提示，WEBZ突变株能够携带未完 成复制的DNA进人细胞分裂期，这是酿酒酵母S期检查点功能丧失的特 征。细胞存活率曲线显示，WEBZ突变株受HU作用时，存活率明显下降， 对HU高度敏感。说明正是由于WEBZ基因突变，导致S期检查点功能丧 失，受HU作用时尽管DNA合成受抑制，但是细胞却无法阻滞在S期，而是 进人GZ／M期进行异常分裂增殖，最终导致细胞死亡。所以，WrT7BZ基因除 了有解链酶作用，还参与酿酒酵母 S期检查点调控，位于已建立的 S期检查 点通路上。由于WEBZ蛋白与人染色体10q21．3－22．l区编码产物DnaZL （DnaZ helicase like）蛋白高度同源，因此研究WEBZ基因在酿酒酵母S期检 查点调控中的作用，可以推知人类DnaZL蛋白的酶活性，从而加深对真核 细胞检查点调控的了解。 第二部分WEBZ基因在酿酒酵母S期检查点通路上调控RNR3基因表达 一一一一urr～BZ在酿酒酵母S期检查点通路上的工作位点（一） 在前一部分的研究中，已初步证实WEBZ基因参与酿酒酵母S期检查 点调控机制，因此在后续的研究中主要是确定WhBZ在检查点通路上的位 置。芽殖酵母在DNA受损伤或DNA合成阻断时，通过S期检查点，一方面 阻断细胞周期，另一方面诱导RNR3等基因的转录表达。RNR3基因编码 产生糖核酸还原酶，催化核糖核着酸还原生成相应的脱氧核糖核着酸大亚 基，在细胞内DNA合成过程中起着关键的作用。 在本研究工作中，利用已有的pZZI质粒，其上携带一个880hp的 ·2· RNR3 DNA片段，位于其开放读码框架880河 之间，根据文献报道， 利用h＊和B—HI酶切获得该RNR3基因片段，取代PNN407质粒上 RNRZ片段，使其与融合表达载体上LacZ相匹配，产生RNR3－eZ转录 融合子，获得RNR3重组质粒。融合表达载体既含有大肠杆菌质粒片段，又 含有酵母菌自主复制序列和酵母菌中心粒序列，可以在大肠杆菌和酵母菌 中复制，并携带AP及URA基因作为遗传标记。将RNR3重组质粒转人大 ．肠杆菌，筛选 Ap十的转化株提取质粒 DNA，采取二种方法进行鉴定，通过 酶切图谱分析和Southern Blot分析表明重组质粒中含有RNR3目的基因。 在正常生长条件下，RNR3基因不转录，当酵母细胞DNA受损伤，如 UV、MMS作用；或是 DNA合成阻断剂如 HU都可以诱导 RNR3的转录。将 RNR3重组质粒转化酵母细胞，利用URA遗传标记筛选转化株，通过