收藏本站
《中国医科大学》 2002年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

人类BSP蛋白相关新基因的cDNA克隆、定位和表达

罗阳  
【摘要】: 前言 BSP(bovine seminal plasma)蛋白是牛精浆中的主要蛋白质,BSP蛋白可以与胆碱或磷脂胆碱结合,黏附于精子表面,可促进由肝素、HDL等诱导的获能过程,另外BSP蛋白与不同来源的胶原、纤维蛋白原、肝素、钙调蛋白、IGF-Ⅱ、apoA-Ⅰ等结合,BSP蛋白还可抑制精子胞膜上的胆固醇迁移,这些都暗示了BSP蛋白在精子胞膜的脂类代谢及调节精子的获能以及顶体反应方面发挥重要作用。目前在猪及马的精浆中都发现了与BSP蛋白同源的蛋白质的存在,这些蛋白具有与BSP相似的结合特性,说明BSP蛋白及其同源蛋白在哺乳动物中是广泛存在的,并具有其生理意义。而在人的生殖系统中与BSP功能相关的蛋白质至今未见报道。为了进一步发现和研究BSP及其相关蛋白在受精及受精卵发育中的重要作用,我们克隆出人与BSP蛋白相关基因的cDNA,将其命名为HBRP(Human BSP-Related Protein)。经BLAST分析,在GenBank未检索到与之相同的蛋白,我们对HBRP基因的染色体定位以及在人体各组织中的表达分布情况进行了研究,并将该基因编码的蛋白进行了原核表达。通过基因重组技术大量获得表达蛋白,并检测了其对蛋白激酶C(PKC)活性的影响,对进一步研究新蛋白的生物学功能具有重要的意义。 材料与方法 1.3′-RACE和5′-RACE PCR反应 参照GenBank数据库人睾丸组织表达序列标签(expressed sequence tag,EST)序列(AA429491),设计3′-RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)基因特异性引物,以Human Testis Marathon-Ready cDNA为模板,使用Marathon~(TM)cDNA Amplification Kit和Advantage DNA Polymerase,采用巢式PCR(Nested PCR)方式,进行3′-RACE PCR反应。在此基础上设计5′-RACE PCR反应引物,进行5′-RACE PCR反应。1%琼脂糖凝胶电泳检 测扩增产物。 2.山NA的克隆和测序 将得到的 3’一及 5’-sCE PCR产物符合预期长度的片段,分离后纯 化、回收,克隆到TA克隆载体PMD-18T,转化E.COlt JM109感受态细胞, 菌落PCR筛选鉴定阳性克隆,用M13通用引物进行DNA序列测定。测序 结果经微机处理拼接,确定正确CDNA序列。在序列的两端设计引物,PCR 扩增全长CDNA,克隆后测序分析。 3.全长山NA序列及其编码蛋白质的计算机分析 从CDNA的序列推导出它所编码的氨基酸序列,应用NCBI提供的 BLAST程序在 GenBank数据库和蛋白质数据库进行同源性比较分析,在N- tP://。exPasy.oh/csi-biVscanProsite分子生物学网站中进行蛋白质的 功能基序分析。 4.HBRP基因的染色体定位 使用 Stanford G3 RHkadiation hybrid)嵌板,在所要定位基因的 3’非翻 译区(untranslated region,UTR)设计引物,预先扩增人基因组DNA,电泳检 测产物大小,继之扩增G3 RH panel,重复两次,将PCR结果输人斯坦福人 类基因组中心(SHGC)的主页(http://、-ShgC.S格五b*·edVRH/H/rh serverfo…ew.htlnl人得到与待定位基因距离最近的SHGC标签号,最后借 助于RH图谱和基因组遗传图谱找到相对应的染色体区带。 5.RT—PCR 采用TriZOI一步法提取正常组织总RNA,反转录合成CDNA。于HBRP 基因的第23外显子处(跨过一个内含子)分别设计上下游引物,引物之间 的山NA长度为250hP,PCR检测HBRP基因在人体各组织中的表达分布。 应用人p-actin引物进行RT-PCR作为内对照。1.5%琼脂糖凝胶电泳检 测表达结果。 6.HBRP表达质粒的构建 以克隆在PMDJ8T的全长CDNA为模板进行PCR扩增,在引物序列 5’端引人 BamH酶切位点和起始密码,3’端引人 Xho酶切位点,分别将 PCR产物和 GST基因融合载体pGEX-SX一且用 BamH和 Xho双酶切, 回收纯化后,16℃3 h完成连接反应,转化 E.COlt B* 感受态细胞,菌落 PCR筛选鉴定重组阳性克隆,质粒提取,B。mH和 Xho双酶切消化鉴定 ·2· 插人片段。选择阳性克隆做测序分析,确定正确阅读框架克隆。 7.融合蛋白的表达 将正确读框的单克隆菌以及含母本 PGEX质粒的转化菌在2 X YT培养 基中(含AmPicillin 100 m牙L乃7丫:培养至A。为0.5-1时,加人终浓度为 0.InunoUL的I工G,诱导表达3h,离心收集菌体,PBS洗涤,超声波破碎, 加人 Tritoall一 至终浓度为 1%后混匀,离心收集上清,即为蛋白质粗提 液,SDS-PAGE检测表达情况。 8.Western印迹分析 经初步纯化的融合蛋白用12%SDS-PAGE分离,然后转移到硝酸纤 维素膜上,用含二%BSA的 TBST封闭。抗 GST抗体用作一抗,碱性磷酸酶 偶联的羊抗鼠IgG作为二抗,用N13T/BCIP底物显色。 9.重组蛋白对PKC活性的影响 从大鼠脑中分离纯化蛋白激酶 Chrotein kinase C,PKC厂LJ Histone H; 为底物,*/zP」-ATP标记测定 PKC活性,收集有活性部分,采用考马斯 亮兰法测定蛋白浓度。使用 Glut。Lthione SePharose 4B纯化表达的 GST和 GST-HB即融合蛋白,分别检测不同浓度的GST蛋白及GSP-HB地融合 蛋白对PKC活性的
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q785

手机知网App
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前6条
1 何凯莉,顾柏炜,张庆华,傅刚,吴济生,韩泽广,曹文俊,邹隽,茅矛,刘建湘,陈竺,陈赛娟;辐射杂种细胞系技术在基因定位中的应用[J];中国科学C辑:生命科学;1999年01期
2 何志巍,陈南岳,廖新波,蔡康荣;细胞周期和骨架在CNE-2Z细胞凋亡中的变化[J];生物化学与生物物理进展;1997年03期
3 邢桂春,张成岗,魏汉东,贺福初;采用RACE技术获得全长人新基因MAGE-D1[J];中国生物化学与分子生物学报;2001年02期
4 罗阳,张学,刘莹,姜莉,刘兴元,于秉治;人牛精浆蛋白相关新基因的cDNA克隆、定位和表达[J];中国生物化学与分子生物学报;2002年02期
5 胡维,向华,周艳,刘敬忠;用PCR法直接快速筛查重组阳性克隆[J];生物技术通报;1999年06期
6 于秉治,于爱鸣,王选仁,侯伟建,张玉霞,宗志宏;牛精子中蛋白激酶C抑制剂的纯化[J];中国医科大学学报;1989年04期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 苏湘鄂;聂晓云;;不同分化期乳腺癌细胞PKCs的表达及其对TNFα的敏感性[J];癌变.畸变.突变;2006年04期
2 任重,马明,宗志宏;喉癌与蛋白激酶C及其抑制物的关系[J];癌变.畸变.突变;1998年03期
3 姜宏,李麓芸,卢光琇;PCR法直接筛选重组阳性克隆[J];安徽医学;2005年02期
4 生秀杰,周伟强,姜莉,张梅英,王太一,张学;小鼠Doc-1R基因的克隆及其表达[J];癌症;2002年02期
5 邬珺超,蒋滢;cDNA末端快速扩增技术的研究进展[J];氨基酸和生物资源;2003年01期
6 丁宁;朱晓琴;冯永庆;秦岭;;改良RACE技术克隆板栗短雄花序26S核糖体基因片段[J];北京农学院学报;2008年01期
7 邓雪柯;殷建华;曹毅;;3种5’RACE技术的比较与优化[J];成都医学院学报;2007年01期
8 韩婧;RACE技术及其研究进展[J];沧州师范专科学校学报;2005年02期
9 唐克轩,开国银,张磊,潘征,赵凌侠,孙小芬,郑金贵;RACE的研究及其在植物基因克隆上的应用[J];复旦学报(自然科学版);2002年06期
10 林能锋,许斌福,曾红;PCR法筛选大黄鱼微卫星DNA[J];福建畜牧兽医;2005年02期
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 郭新军;拟黑多刺蚁肌细胞增强因子2与肌钙蛋白Ⅰ亚基基因的克隆及其在发育中的表达研究[D];陕西师范大学;2010年
2 李大力;蜂毒溶血肽及其前体蛋白cDNA的克隆、定点突变和在大肠杆菌中表达的研究[D];大连理工大学;2000年
3 韩英;胃癌细胞耐药相关分子的表达、信号转导途径和离子通道特性的研究[D];第四军医大学;2001年
4 李秋莉;辽宁碱蓬甜菜碱合成酶基因克隆及转基因烟草耐盐性研究[D];大连理工大学;2002年
5 马长艳;中华绒螯蟹卵巢发育相关基因的研究[D];南京师范大学;2003年
6 田玉楼;Cyclin G2抑制细胞增殖的实验研究[D];中国医科大学;2002年
7 戚金亮;苹果铁高效基因型生物技术的研究——MxNrampl和MxIrtl基因的克隆[D];中国农业大学;2003年
8 沈元月;脱落酸(ABA)结合蛋白基因克隆、表达及其产物对ABA的特异结合[D];中国农业大学;2003年
9 杨兴龙;PDK分子PH结构域与蛋白激酶B在胃癌细胞抗脱落凋亡中的相互作用[D];中国人民解放军第一军医大学;2003年
10 刘雨星;电针对老年性痴呆大鼠海马组织信号转导介质的调节作用研究[D];成都中医药大学;2003年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨堃;鹅CYP7A1基因克隆、表达调节及表达规律的研究[D];华中农业大学;2010年
2 李晓萍;三疣梭子蟹微卫星富集文库的构建及五个野生地理群的多样性分析[D];中国海洋大学;2010年
3 于美沁;兔后发性白内障形成中kistrin干预对FAK及ERK信号因子的早期影响[D];广西医科大学;2011年
4 彭艳辉;波纹唇鱼微卫星分子标记的开发及其遗传多样性分析[D];海南大学;2011年
5 郭虎;佛波醇提取分离工艺研究[D];重庆医科大学;2011年
6 江雪梅;球药隔重楼甾体皂甙生物合成相关功能基因的克隆与组织表达分析[D];中南大学;2011年
7 吴晓东;佛波酯对人肺腺癌A549细胞增殖和侵袭能力的影响[D];郑州大学;2011年
8 贾琳琳;王鸽α-Syn基因克隆及AVM急性中毒对其在脑组织中表达的影响[D];东北农业大学;2011年
9 李婷;黑鲷MSTNⅡ基因分子特征[D];宁波大学;2009年
10 徐丽华;鲤脑组织低温差异表达候选基因的筛选、cDNA全长克隆及功能预测[D];上海海洋大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前7条
1 刘敬忠,向华,张纪平,毛燕玲,赵离钟,张鹏,朱章菱,翁心植,卢圣栋;筛查基因突变的新技术──循环双脱氧指纹图谱法及其应用[J];高技术通讯;1996年01期
2 何凯莉,顾柏炜,张庆华,傅刚,吴济生,韩泽广,曹文俊,邹隽,茅矛,刘建湘,陈竺,陈赛娟;辐射杂种细胞系技术在基因定位中的应用[J];中国科学C辑:生命科学;1999年01期
3 陈南岳;蛋白激酶C在细胞生长与恶变过程中的调控作用[J];生物化学与生物物理进展;1991年04期
4 刘敬忠,向华,胡维,朱章菱,祝瑾,李氢元;苯丙氨酸脱氨酶cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达[J];生物工程学报;1998年04期
5 邢桂春,张成岗,魏汉东,贺福初;采用RACE技术获得全长人新基因MAGE-D1[J];中国生物化学与分子生物学报;2001年02期
6 林仲翔;;微丝骨架蛋白分子重组与细胞转化[J];细胞生物学杂志;1990年03期
7 陈南岳,赵明伦,鲍波;蛋白激酶C亚型在鼻咽癌细胞中的分布及在增殖中的作用[J];中国病理生理杂志;1994年06期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 罗阳,宗志宏,于秉治;一种新的精子结合蛋白HBRP在原核表达及其活性研究[J];细胞生物学杂志;2003年04期
2 马长艳,周开亚,郭豫杰,赵乃刚,汪朝晖;中华绒螯蟹卵巢新基因EJO6的全长cDNA克隆和序列分析[J];南京师大学报(自然科学版);2003年03期
3 张杰,刘莹,惠答美,宿文辉,宗志红,于秉治;人新基因HBRP基因工程细胞系的建立[J];中国生物工程杂志;2004年05期
4 朴;促使细胞自杀的“Fas”的cDNA克隆化成功[J];中国生物工程杂志;1992年06期
5 王福生;丙型肝炎病毒的分子遗传学研究现状[J];军事医学科学院院刊;1993年03期
6 张勇群;代龙军;陈金军;蒋立平;刘中华;梁宋平;;一种新的从新疆穴居狼蛛中鉴定的细胞裂解肽(英文)[J];中国生物化学与分子生物学报;2009年09期
7 刘海峰;杨成君;赵权;李波;王军;;山葡萄中类黄酮3’-羟化酶基因(F3’H)cDNA的克隆和分析[J];植物生理学通讯;2009年12期
8 黄震宇,朱伟民,洪锦心;PCR技术在单克隆抗体cDNA的筛选及标记同位素探针上的应用[J];细胞与分子免疫学杂志;1992年04期
9 赵崇,王立斌,宋学文,张镜宇;大鼠脑神经元特异性烯醇化酶基因的cDNA克隆及序列分析[J];中国生物化学与分子生物学报;1994年03期
10 王罡,万里川,胡汉桥,王萍,吴颖,季静;小麦抗白粉病特异表达cDNA克隆的分子生物学研究[J];生物技术通讯;1997年Z1期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张杰;刘莹;宗志宏;惠答美;刘奕;于秉治;;人新的蛋白激酶抑制剂HBRP功能的研究[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
2 张杰;刘莹;惠答美;刘亦;宿文辉;宗志红;于秉治;;新的蛋白激酶抑制剂HBRP基因真核表达体系的建立[A];第七届全国酶学学术讨论会论文摘要集[C];2004年
3 张冉;易新元;曾宪芳;;日本血吸虫新基因克隆及DNA疫苗的构建和保护性研究[A];中国动物学会全国第九次寄生虫学学术讨论会论文摘要集[C];2003年
4 刘燕;周健;刘新平;药立波;惠延年;;新基因c24的克隆及其在正常及白内障晶状体上皮细胞的表达[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
5 雷坚;王慷慨;刘小柳;刘瑛;王桂良;蒋磊;刘梅冬;肖献忠;;HIF-1对H9c2心肌细胞新基因Mipu1表达的影响及其机制研究[A];第七届海峡两岸心血管科学研讨会论文集[C];2009年
6 张永莲;;附睾特异的程序化表达的新基因的研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
7 景孝堂;范文红;吴燕;杨应忠;范明;;神经发育中低氧相关新基因的筛选[A];中国生理学会第六届应用生理学委员会全国学术会议论文摘要汇编[C];2003年
8 梅红;童强松;汤绍涛;普佳睿;杨春雷;张桓瑜;;肾脏特异性表达基因KSEG-1的克隆及序列分析[A];中华医学会第八次全国小儿外科学术会论文集[C];2010年
9 杨静;诸欣平;张新梅;高欣;杨雅平;刘明远;P.Boireau;;旋毛虫成虫期特异性新基因的筛选与序列分析[A];中国动物学会第六届全国青年寄生虫学工作者学术讨论会论文摘要集[C];2000年
10 于廷曦;朱应葆;童坦君;;人类DNA修复新基因HR24L抑制凋亡[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 佘超龙;川籍女大学生血液中发现一新基因[N];科技日报;2004年
2 康文远;从口腔中克隆6个新基因[N];健康报;2000年
3 孙晓素宁习源 黄治才;也可能这种新基因什么作用都没有[N];南方日报;2008年
4 记者贾晓惠 通讯员黄显斌 唐明山;我国首次发现丙型肝炎病毒新基因[N];科技日报;2002年
5 吴志军;肝细胞生成素等人胎肝来源新基因获创新成果[N];科技日报;2006年
6 吴一福;四军医大首次发现人脑抑癌新基因[N];中国医药报;2005年
7 陈勇;美发现影响胚胎发育新基因[N];光明日报;2005年
8 黎明 译;基因治疗:新基因会传给下一代吗[N];科技日报;2002年
9 陈茂梁 朱炜 王跃芳;两个人类白细胞抗原新基因被发现[N];健康报;2004年
10 记者 杜有全;第四军医大学克隆出六个人类口腔新基因[N];中国商报;2000年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 罗阳;人类BSP蛋白相关新基因的cDNA克隆、定位和表达[D];中国医科大学;2002年
2 李华;嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilium)热稳定性β-1,3-葡聚糖酶的纯化特性及cDNA克隆[D];山东农业大学;2008年
3 韦星;新基因MIP2的表达及心肌细胞保护作用研究[D];中南大学;2010年
4 王骥;福寿螺(Ampullaria crossean)多功能纤维素酶EGX的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
5 许守明;小盐芥C_2H_2类锌指蛋白基因ThZF1的克隆及其功能研究[D];中国农业大学;2005年
6 张付云;壳寡糖诱导烟草抗性相关基因的克隆和鉴定[D];中国科学院研究生院(大连化学物理研究所);2007年
7 童斌;柿果实扩张蛋白cDNA克隆及其生物活性研究[D];西北农林科技大学;2003年
8 朱玲;扇贝丝氨酸蛋白酶及其抑制剂基因的克隆与表达[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2006年
9 刘卫霞;人钙周期素结合蛋白(CacyBP)基因的克隆和功能研究[D];中国协和医科大学;2002年
10 陈静;嗜热毛壳菌热稳定糖化酶纯化及其编码基因的克隆与表达[D];山东农业大学;2006年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘兴元;HBRP的表达、纯化与生物学活性分析[D];中国医科大学;2002年
2 关奕;HBRP在原核细胞中的表达与纯化[D];中国医科大学;2004年
3 李勇;母猪繁殖力相关新基因的研究[D];中国农业科学院;2009年
4 赵战勇;新基因dp3的克隆表达及其功能初步研究[D];西北大学;2004年
5 王姝雅;阴道毛滴虫病毒基因组全长cDNA克隆[D];吉林大学;2006年
6 张佳;疏绵状嗜热丝孢菌超氧化物歧化酶(Mn-SOD)基因的克隆和表达及性质研究[D];山东农业大学;2009年
7 朱景全;家蝇金属硫蛋白的cDNA克隆与序列测定[D];华中农业大学;2003年
8 张广操;耐热大豆β-淀粉酶的筛选及其cDNA在大肠杆菌中的表达[D];中国农业科学院;2005年
9 马云芳;斑马鱼(Danio rerio)P-糖蛋白cDNA的克隆及表达分析[D];西南大学;2008年
10 尹志亮;绢丝昆虫柳蚕卵黄原蛋白(Vg)cDNA的克隆及序列分析[D];安徽农业大学;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026