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《中国医科大学》 2002年
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宽频噪音对AD模型鼠听觉记忆及中枢机制的研究

朱启文  
【摘要】: 前言 一氧化氮(nitric oxide,NO),是一种的气体化学信使分子,在动物各种生理功能包括神经系统,诸如神经元间信息传递、突触可塑性、记忆形成、受体功能、细胞内信息传递及神经递质的释放等活动中具有普遍的调控作用。NO被认为是与谷氨酸神经毒性相联系的中枢神经系统的一些基本疾病有关。各种原因引起的刺激都会使大鼠大脑皮层NO产生大量增加。NO由一氧化氮合成酶NOSs(包括ncNOS、iNOS和eNOS)合成和调控。当神经元突触前膜释放谷氨酸,激活突触后膜的NMDA受体,导致Ca~(2+)内流与钙调蛋白结合,从而激活原生型NOS。丝裂素活化蛋白激酶(Mitogen Activated Protein Kinase,MAPK),也被称为细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK),在所有真核细胞中是信号从细胞表面转导到细胞内部的重要传递者,包括p44/ERK1和p42/ERK2,MAPKs代表了几乎所有信号通路的集中点,从而调节一系列细胞活动。胶质细胞源性神经营养因子(glial derived neurotrophic factor,GDNF),首先是在多巴胺能神经元中发现其具有营养作用的。新近资料表明GDNF可促进神经元存活,在损伤性动物模型中常有不同关联表达。GDNF介导的神经保护作用是由于MAPK通路被激活,使NMDA诱导Ca~(2+)内流减少所致。NMDA(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体为谷氨酸神经递质靶受体的一种,包括NR1、NR2(NR2A、NR2B和NR2C)及NR3等亚型,不仅调节N_(a+)、K~+通道,还控制Ca~(2+)通道。当被激活时,有跨膜N_(a+)-K~+流动,也有大量Ca~(2+)流入胞内。Ca~(2+)可作为第二信使,可能直接或间接使膜受体发生改变,从而改变突触效率,产生记忆。NMDA受体亚基中只有当NMDAR1(ζ1)亚基与NMDAR2'A(ε1)亚基一起表达时NMDA受体通道才能形成作用。 谷氨酸(glutamic acid)为中枢兴奋性递质之一,其靶细胞为含有mGluR_(1-7)(代谢性谷氨酸受体)、NMDA受体及非NMDA受体的神经元,其在兴奋性突触传递、学习和记忆及神经可塑性等方面具有重要功能,但是谷氨酸过量释放时,通过一系列反应,使细胞内Ca~(2+)增加,导致神经元变性和 坏死。选择性海马CA;区锥体神经元坏死是神经变性领域的中心课题之 一,因为其直接与记忆损伤有关。衰老及阿尔采默病(al.------eimer’s disease, AD)等神经退行性疾病的显著特征之一是中枢学习记忆功能障碍,各种神 经毒素被用于建立AD动物模型,为此,我们利用过量谷氨酸神经元毒性作 用建立大鼠AD模型,探讨宽频噪音对模型大鼠不同脑区 NOSI、ERK、GD- NFJ J 表达及ABR阈值的影响,以揭示它们在分子水平 存在的相互联系及机制。 实验材料 L谷氨酸购自Sima公司,一氧化碳合酶(NOS;入GDNF多克隆抗体 购于北京中山生物韩术公司(Santa进口分装人磷酸化一P44/42MAPK (Thr202/Tyr204)单克隆抗体购于美国 New England Biolabs.Inc;NMDARI (el)、NMDARZA(1)多克隆抗体购于 santa c删e biotechnology公司;TR- IZOL试剂盒(Gibco/BRL,USA),ECL发光试剂盒(Pamacia,USA)。 实验方法 二.动物及模型制备取体重150-2209 SD大鼠,雌雄不拘,由本校动物 部提供,经行为训练筛选,剔除记忆差(指“稍有记忆”和“无记忆”)大鼠 后,随机分成 3组:双侧海马 CA;区微量注射谷氨酸组h=25h双侧海马 CAI区微量注射生理盐水组h=20*空白对照组h=20人将动物用 3% 戊巴比妥钠k5 m才kg,lP)麻醉后,固定于江湾一IC型立体定位仪上。AD 大鼠模型的建立参照大鼠脑立体定位图谱(Pellegrino nd Cushman图谱人 在立体定位仪上取位于App.2-3.4,n.0-2.4,HZ.8J.0,谷氨酸组每 侧微量注射 0·lpy谷氨酸,每侧注射 0.5 pl。此法参照 Masaomi Miyamo- t*’]。生理盐水组注射同等体积的生理盐水。术后青霉素注射预防感染。 2.被动回避反应(Passive聊oidance response,,PAR)训练 3.听脑干反应(ABR)测试动物用 2%戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射 麻醉后,常规方法进行听脑干反应测试,记录听阈,测试在隔音的电屏蔽室 内进行。电极分别置于颅顶正中皮下(两外耳道连线正中)及两侧乳突,颅 ·2· 顶电极为(+L测试侧耳后电极为(刁,对侧耳后电极为接地电极。屏蔽 耳机距测试大鼠外耳道口 0.scm。用 Danac-7型声刺激器施与以ZkHz为 主频率的交替短声刺激hliCk人以ATAC-450生物记录系统采样,观察时 程为 20ms,叠加 200次,间隔 90ms,带通滤波50-3000Hi,测试声响从95dB SPL开始,以5 dB逐项递减,听阈判定以Ps波为准。 4.施加噪音刺激 5.蛋白免疫印迹(Western Blot) 6.细胞总RNA的提取及RT—PCR 7.图象分析与数据处理 实验结果 *)双侧海马CA;区微量注射谷氨酸前,电击后24h有记忆者.为69. 6%,损伤后仅为 14.7%,两者差别非常显著帅<0.of人 ①三组
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q42

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