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《中国医科大学》 2003年
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真空冷冻干燥保存兔角膜内皮细胞的光/电镜酶组织化学实验研究

杨宏伟  
【摘要】: 前言 真空冷冻干燥保存法(VFDP)保存角膜技术是在深低温冷冻保存法和脱水干燥保存法基础上建立起来的。它是将离体的角膜组织经过深低温冷冻使组织内的水分凝结成固态,然后在真空条件下使固态的水升华。评价保存效果的关键是对角膜内皮细胞活性的检测。角膜内皮细胞活性可反映在内皮细胞的酶活性上。利用光镜、电镜酶组织化学方法可测定兔角膜内皮细胞酶活性。本实验研究旨在通过光镜、电镜酶组织化学方法对冻干保存的兔角膜内皮细胞的三磷酸腺苷酶(ATPase)及琥珀酸脱氢酶(SDH)进行检测,从而判定真空冷冻干燥保存法(冻干法)对于兔角膜内皮细胞活性的影响。 材料和方法 1 实验设备及试剂 真空冷冻干燥机(东北大学制造) 二甲基亚砜、柠檬酸铅、四唑氮蓝、琥珀酸钠、左旋咪唑等:美国SIGMA化学试剂有限公司。 20%人白蛋白:上海莱士血制品有限公司。 简易降温仪(自制) 2 动物来源及分组 成年大耳白兔,2.5~3.0kg,18只 根据随机原则及配对原则将36只兔眼分为3组,每组12只,分别为冻干实验组、冷冻对照组和新鲜对照组。 3基本操作 3.l配制冷冻保护液: 二甲基亚矾(DMSO)浓度(V/V)为5%上%,与20%人白蛋 白配制成2.sml的保护液。 3.2制备兔角膜片: 制作出一个带2—3nun巩膜环的角膜片。 3.3配制复水液: 1640加 20%兔血清 3.4深低温冷冻保存兔角膜: 4t条件下将角膜片依次放人1号液在号液中各平衡20 win;梯度降温;液氮内保存; 3,5真空冷冻干燥保存兔角膜: 冷冻前处理及梯度降温同深低温冷冻法。冻干机内冻干,充 氮封盖。室温或冰箱保存。 3.6冷冻角膜的复温 3.7冻干角膜的复水 4光镜酶组织化学方法 4.INa”-K”三磷酸腺耷酶(Na”-K”-ATPase)显示法 新鲜角膜片、冷冻复温角膜片、冻于复水角膜片标记,固定,漂 洗,置于AWe孵育液内孵育60ndn,反应后的处理,明胶封片, 光镜观察,为细胞膜上的棕色颗粒 4.二貌来酸脱氢酶门DH)显示法 新鲜角膜片、冷冻复温角膜片、冻于复水角膜片置于SDH孵 育液内孵育,后固定,漂洗,甘油明胶片片,光镜观察。为胞浆内的 蓝色颗粒。 5电镜酶组织化学方法 孵育的组织后固定,漂洗,梯度脱水,EponslZ包埋,制作超薄 切片,醋酸铀染色透射电镜下观察,拍片。 ·二· 6统计学分析: 应用Metajnrph图象采集系统,测定角膜酶染色切片的积分 光密度值,应用 SPSSll对软件对数据进行统计学处理。 实验结果 亚光镜酶组化的观察结果 ATPase和SDH新鲜角膜、冷冻角膜、冻干角膜均呈阳性反 应。实验组与对照组相比,颜色较浅,平均积分光密度值较低,差 异具有统计学意义河d.01) 2电镜酶组化的观察结果 ATPase新鲜角膜、冻干角膜上可见细胞膜连续完整,有黑色 的ATh酶颗粒均匀沉着于细胞膜上。冷冻角膜见细胞膜不连续, 黑色的酶颗粒存在于细胞膜上及细胞内。 SDH三组标本均为内皮细胞层脱落,末能观察到结果。 讨 论 角膜的冻干保存法是在深低温冷冻保存法及干燥保存法的基 础上建立起来的。冻于的角膜片可以在冰箱及室温下保存,运送 方便,成本较低,值得研究。冻干法保存角膜的过程包括深低温冷 冻阶段和干燥阶段。首先,对离体的免角膜片进行深低温冷冻。 将冷冻后的角膜片迅速移至真空冷冻干燥机的干燥室内。利用控 制其真空度的方法使角膜组织内固态的水升华。使用时在适当的 条件下复水,使干燥的组织尽可能恢复其原有的生理状态。 角膜内皮细胞存在着多种酶,其中活性较高的为统来酸脱氢 酶、苹果酸脱氢酶,ATP酶,酸性磷酸酶等。这些酶均参与细胞内 的组织代谢过程。应用酶组织化学法测定内皮细胞的酶活性,可 ·3· 以间接地反映内皮细胞的活性。 本实验中三组标本ATPse和SDH酶组织化学染色光镜观察 鲫呈阳性反应,细胞形状清晰可见,为规则的六角形,说明三组 标本的内皮细胞ATPase和SDH酶均有活性。活性反应的强弱程 度是应用图像分析系统进行积分光密度值的测定用S伯统计软 件来进行分析。结果表明冻干保存的兔角膜内皮细胞与新鲜及冷 冻保存的角膜内皮细胞一样均具有一定的活性,但也存在一定的 差异。冻干组的平均积分光密度值比对照组(冷冻组和新鲜组) 的平均积分光密度值低,差异具有统计学意义。孙为荣等曾报道 过关于冷冻保存角膜内皮细胞的酶组织化学观察,与本实验结果 类似。 电镜酶组织化学方法观察到ATPase酶颗粒在细胞膜上呈线 性连续分布,余改变与石珍荣所报道的相一致。SDH电镜未观察 到结果。考虑是由于SDH染色时先孵育,后固定,引起角膜水肿, 单层的内皮细胞容易脱落所致。 冻干保存兔角膜的技术在国内外尚无先例,
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R77

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【引证文献】
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1 闫震;玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63固态发酵培养基及其活菌制剂的研究[D];河北农业大学;2010年
【参考文献】
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1 刘金刚,葛风英,马春凤,王瑞东,王沛涛,王传富,鞠明诚,石珍荣,孙为荣,金梅玲,牛膺筠;深低温长期保存角膜技术的研究——Capella法及其改良[J];青岛医学院学报;1988年02期
2 王传富,鞠明诚,金梅玲,牛膺筠,刘洪美,刘金刚,葛风英,马春凤;深低温长期保存兔角膜穿通性移植的动物实验[J];青岛医学院学报;1988年02期
3 刘金刚,王传富;深低温保存角膜二步法冷冻技术的研究[J];青岛医学院学报;1988年04期
4 石珍荣,周惠民,王传富;低温冷冻保存角膜的超微结构观察[J];青岛医学院学报;1989年01期
5 于纯智,张廷钺,马吉献,刘健,周扣珍;无水氯化钙干燥长期保存角膜与正常新鲜角膜形态学上的区别[J];解放军医学杂志;1986年02期
6 王传富,鞠明诚,石珍荣,孙为荣,金梅玲,牛鹰筠,刘金刚,葛风英;简易法深低温保存角膜的实验和临床评价[J];眼科研究;1990年04期
7 孙为荣,王传富;深低温保存角膜内皮细胞的酶组织化学观察[J];眼科研究;1991年01期
8 王荣光,邹留河,董东生;干燥保存角膜片在真菌性角膜溃疡手术治疗中的作用[J];中华眼科杂志;2000年01期
9 刘红山,戴玲,秦勇,龚向明,冯宗榴;深低温长期保存角膜穿透移植术后角膜内皮分析[J];中国实用眼科杂志;2002年08期
10 高明宏,蓝平,孟彤柏,曲静涛,夏国英;深低温保存对穿透性角膜移植术后植片厚度和内皮细胞的影响[J];中国实用眼科杂志;2002年12期
【共引文献】
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1 王传富,孙为荣,王大博,崔向东,傅秀艳;深低温长期保存巩膜的动物实验和临床应用[J];青岛医学院学报;1996年03期
2 周善璧,陈家祺,黄挺,陈龙山,许丽英;深低温保存角膜缘干细胞活性实验研究[J];重庆医学;2000年06期
3 邹惠芬,徐成海,张世伟,陈晓隆;角膜在冷冻过程中的传热分析[J];东北大学学报;2002年02期
4 张廷钺,于纯智,马吉献,彭秀军;保存角膜与新鲜角膜移植的临床观察[J];第四军医大学学报;1988年01期
5 张廷钺,于纯智,马吉献,彭秀军,梁厚成,魏正乾,刘健,谷法有,李学荣,杨传红;干燥保存兔角膜的内皮细胞形态特征[J];第四军医大学学报;1990年01期
6 张廷铖,于纯智,马吉献,彭秀军,刘健,魏正乾,谷法有,李学荣,杨传红;干燥保存人角膜与新鲜角膜内皮细胞的形态学比较[J];第四军医大学学报;1993年01期
7 马吉献,汤朝武,张廷钺,于纯智;干燥保存兔眼角膜组织活性的检测[J];第四军医大学学报;1993年03期
8 邱姣;王宏伟;周军格;;硫酸软骨素在长期甘油冷冻保存角膜中对内皮细胞活性的影响[J];广东医学;2010年21期
9 姚子昂;吴海歌;刘媛媛;囤景鑫;;壳聚糖-硫酸软骨素共混膜与兔角膜基质细胞相容性的研究[J];高技术通讯;2009年11期
10 牛晓霞;洪晶;段辉;刘蕾;;不同保存方法对角膜内皮细胞活性的影响[J];国际眼科杂志;2006年05期
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1 张青;凌沛学;;硫酸软骨素在眼科中的应用[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
2 张青;凌沛学;;硫酸软骨素在眼科中的应用[A];2010年中国药学大会暨第十届中国药师周论文集[C];2010年
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2 牛晓霞;角膜不同保存方法与术后免疫排斥反应相关性的实验研究[D];中国医科大学;2007年
3 高洪瑞;器官培养保存角膜及大泡性角膜病变Na~+-K~+-ATP酶活性及水通道蛋白-1表达的改变[D];第二军医大学;2009年
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1 邱姣;硫酸软骨素在长期甘油冷冻保存角膜中对内皮细胞活性的影响[D];辽宁医学院;2011年
2 张世磊;硫酸软骨素滴眼液抑菌剂的选择研究[D];山东大学;2011年
3 曹永梅;蔗糖对真空冷冻干燥兔角膜内皮细胞保护作用的实验研究[D];中国医科大学;2002年
4 罗琳;深低温保存角膜缘组织活性的实验研究[D];青岛大学;2003年
5 胡进宇;血管深低温保存的实验研究[D];江西医学院;2003年
6 张超;组织工程角膜的体外构建及移植的实验研究[D];第四军医大学;2006年
7 于静;深低温全眼球活性保存角膜的实验研究[D];大连医科大学;2007年
8 高兴爽;壳聚糖基组织工程化角膜内皮细胞载体的制备与性质研究[D];中国海洋大学;2008年
9 霍海涛;不同复温方法对深低温冷冻复合组织血管活性的影响[D];山西医科大学;2012年
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2 钱长英;浅谈农药可湿性粉剂的配方研制及加工工艺[J];安徽化工;2005年01期
3 陶玉贵;生物农药固态发酵条件的研究[J];安徽师范大学学报(自然科学版);2001年01期
4 刘志祥;曾超珍;;响应面法在发酵培养基优化中的应用[J];北方园艺;2009年02期
5 刘大群,杨文香,祁碧菽,王朝花;拮抗链霉菌Men-myco-93-63及其发酵液对棉花黄萎病菌生长的影响[J];河北农业大学学报;1999年04期
6 杨文香,张汀,刘大群;三株链霉菌对黄瓜白粉病及黄瓜生长的影响[J];河北农业大学学报;2005年04期
7 谷春涛,彭爱铭,萨仁娜,佟建明;地衣芽孢杆菌TS-01发酵培养基的优化[J];饲料工业;2003年08期
8 陆星星;;生物农药的发展前景[J];广东农业科学;2009年11期
9 赵铭钦;李晓强;;烟叶微生物发酵机理及生物制剂应用研究进展[J];甘肃农业大学学报;2007年06期
10 杜蕙;我国生物农药的研究与开发进展[J];甘肃农业科技;2003年06期
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1 吴红慧;大豆根瘤菌培养基的优化和剂型的比较研究[D];华中农业大学;2003年
2 李增波;一株生防放线菌的抗菌活性及其应用研究[D];西北农林科技大学;2006年
3 张晓伟;黄芪中有效成分的提取及不同干燥方法的研究[D];山东农业大学;2007年
4 陈晓梅;姜瘟病原菌拮抗放线菌SR-11菌株诱变选育及固体发酵可行性研究[D];四川大学;2007年
5 保玉心;固体发酵黑曲霉产单宁酶的研究[D];贵州大学;2008年
6 赵庆亮;微波真空冷冻干燥苹果片及对比试验研究[D];中国农业机械化科学研究院;2009年
7 刘传都;利用混合菌固体发酵木薯渣生产菌体蛋白饲料的研究[D];华中农业大学;2009年
8 赵国纬;地衣芽孢杆菌L3发酵工艺优化及应用研究[D];华中农业大学;2009年
【二级引证文献】
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1 杨淑;玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63对设施番茄连作障碍的修复[D];河北农业大学;2012年
【二级参考文献】
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1 刘金刚,葛风英,马春凤,王瑞东,王沛涛,王传富,鞠明诚,石珍荣,孙为荣,金梅玲,牛膺筠;深低温长期保存角膜技术的研究——Capella法及其改良[J];青岛医学院学报;1988年02期
2 刘金刚,葛风英,马春凤,李华琴,王沛涛,王传富,金梅玲,牛膺筠;深低温长期保存角膜技术的研究——冷冻保护剂的筛选[J];青岛医学院学报;1988年02期
3 王传富,鞠明诚,金梅玲,牛膺筠,刘洪美,刘金刚,葛风英,马春凤;深低温长期保存兔角膜穿通性移植的动物实验[J];青岛医学院学报;1988年02期
4 王传富,鞠明诚,刘金刚;深低温长期保存角膜穿通性移植的临床研究[J];青岛医学院学报;1988年02期
5 刘金刚,王传富;深低温保存角膜二步法冷冻技术的研究[J];青岛医学院学报;1988年04期
6 石珍荣,周惠民,王传富;低温冷冻保存角膜的超微结构观察[J];青岛医学院学报;1989年01期
7 高永峰,孙秉基,王印其;眼球前段重建术治疗严重真菌性角膜炎的初步探讨[J];眼科;1997年01期
8 赵东卿,孙秉基,王印其,张月琴,李家臣;真菌性角膜炎的临床分级及手术方式选择[J];眼科研究;1997年04期
9 郑湖铃,陈家祺,刘华;两种角膜内皮细胞活性染色的应用比较[J];中国实用眼科杂志;1995年11期
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1 徐培渝,肖邦良,王宗全;氯化镉致小鼠胸腺病理及酶组织化学改变[J];四川大学学报(医学版);1989年04期
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1 张艳;汪海婴;熊希凯;;小鼠中脑红核细胞构筑与酶组织化学观察[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年
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4 张媛;李玉谷;叶远兰;马勇江;周泉鹤;崔聪颖;剡海阔;李楚宣;;H5N1亚型高致病力禽流感病毒人工感染鸭的酶组织化学研究[A];中国畜牧兽医学会动物解剖学及组织胚胎学分会第十四次学术研讨会论文集[C];2006年
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10 郑效东;;优秀的冻干系统制造商——东富龙服务制药工业之路[A];兴业杯首届中国制药装备论文集[C];2005年
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1 苏江;真空冷冻干燥技术可提升成品质量[N];中国渔业报;2005年
2 郝常明 黄雪菊;真空冻干技术基础研究亟待加强[N];中国医药报;2006年
3 通讯员 张文举 冀全喜;希望的种子结硕果[N];朔州日报;2006年
4 崔晓丽 孟令连 陈儒;迁安市扣庄乡:农业稳乡、工业强乡、特色兴乡[N];河北日报;2006年
5 张峰秋;603所“十五”紧紧抓住科研不放[N];中国航空报;2001年
6 记者 马晓蓉;右玉县产业开发项目稳步推进[N];朔州日报;2007年
7 见习记者 杨巧玲;我市两区项目建设稳步推进[N];朔州日报;2008年
8 贾志英 记者 翟培天;锡成加工大做对外文章[N];四川科技报;2006年
9 富丹凤 本报记者 孙 伟;科技创新 质量取胜[N];中国质量报;2005年
10 本报记者 杨杰;开封县:依托优势促发展[N];开封日报;2005年
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1 徐艳阳;毛竹笋真空冷冻与热风联合干燥研究[D];江南大学;2005年
2 石阳;面神经失神经支配后口轮匝肌酶组织化学研究[D];中国医科大学;2003年
3 宋炎成;新型生物陶瓷SCPP的生物学特性研究[D];四川大学;2006年
4 周文斌;经皮穿刺微波凝固治疗在早期乳腺癌中的实验和临床研究[D];南京医科大学;2012年
5 卜寿山;近红外光谱分析技术鉴别周围神经运动束和感觉束的实验研究[D];南京医科大学;2007年
6 蒋佳荔;木材动态黏弹性的温度、时间与频率响应机理研究[D];中国林业科学研究院;2009年
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9 李术;奶山羊氟病毒理学的研究[D];东北农业大学;2001年
10 潘洪富;人死后玻璃体液化学成分含量改变与死亡时间关系的研究[D];四川大学;2005年
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4 张晓峰;兔角膜基质细胞的生物学特性研究[D];苏州大学;2002年
5 于静;深低温全眼球活性保存角膜的实验研究[D];大连医科大学;2007年
6 马俊凯;青岛文昌鱼肌肉生化分析及其功能基因的研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2007年
7 曹永梅;蔗糖对真空冷冻干燥兔角膜内皮细胞保护作用的实验研究[D];中国医科大学;2002年
8 元艺;氯烟复配物及氯代水杨胺灭螺效果及氯代水杨胺杀螺机理的研究[D];武汉大学;2005年
9 邹大军;急性小肠梗阻时血清DAO、MDA及肠壁组织学变化的研究[D];河北医科大学;2007年
10 丁昌懋;胃癌螺旋CT征象与VEGF-C、VEGFR-3表达及淋巴管密度间关系的研究[D];郑州大学;2006年
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