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《中国医科大学》 2003年
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醋氨酚中毒致大鼠肝细胞的凋亡

顾伟  
【摘要】: 前言 凋亡(apoptosis)是细胞的主动性死亡,是机体清除感染、变异及衰老细胞而维持自身生理状态的主要调节方式之一。Fas是一种细胞表面受体,与相应配体结合后活化靶细胞固有的死亡程序,介导细胞毒性细胞(CTL)的细胞毒效应,使肝细胞凋亡。在醋氨酚中毒患者的肝组织中,肝细胞坏死和凋亡均可存在。目前,关于凋亡在醋氨酚中毒肝损伤的机制尚无报道。本研究主要是大鼠醋氨酚中毒时,检测肝组织中Fas/FasL的表达及醋氨酚剂量与Fas/FasL表达和肝细胞凋亡之间的关系,探讨Fas系统导致的肝细胞凋亡在醋氨酚中毒的可能作用及其相互联系。 实验材料和方法 1.醋氨酚中毒动物模型制备:49只Wistar雄性大鼠,体重280-320克,分别给予实验组大鼠腹腔内注射150、300、450mg/Kg体重的醋氨酚溶剂(用生理盐水配制)。给予对照组大鼠腹腔内注射等量生理盐水。观察大鼠表现,8h后每只大鼠分别以脊髓拉断法处死,立即剖开胸腔、腹腔,暴露心脏,剪开心包,剪开左心室,插入导管并固定,同时用手术剪切开右心耳放血,然后用PBS缓冲液从左心室导管注入,灌注速度由慢至快,经过体循环,从右心耳流出,重复上述过程,直至肝脏颜色 由鲜红色变为灰白色,且从右心耳流出液变清澈。用组织剪将肝 叶分离出来,置于10%福尔马林溶液中固定,经脱水、透明。 浸蜡后制成石蜡标本,每份标本作连续切片进行系列检测。 2.检测: ①肝细胞Fas/FasL表达检测:石蜡切片常规脱蜡、水化, 继以免疫组化试剂盒Onununostain SP kit)检测,步骤按说明书 进行。最后常规DAB显色,苏木素复染,中性树胶封片。 ②肝细胞凋亡的检测:石蜡切片常规、水化,再用DNA末 端原位标记染色试剂盒检测,按说明书步骤进行。最后常规 DAB显色,苏木素轻染,中性树胶封固。 ③对照组:阳性对照用对照组肝组织按以上方法分别检测 凋亡和Fs/FsL表达,阴性对照用PBS缓冲液分别代替Fs单 抗,FasL多抗按上述方法进行对照检测。 3.结果判定标准: ①Fas/FaSL阳性细胞为胞浆和/或胞膜棕褐色染色,阳性程 度分三级:阳性细胞仅见于中央静脉周围、或少数在碎屑样坏死 区为(+h在碎屑样坏死区有较多数为(订厂在肝小叶中也 有弥漫分布为(++十八 ②肝细胞凋亡程度判定:细胞核呈棕褐色染色为阳性,无 细胞核棕褐色染色为阴性。以凋亡指数(选择 1-3个400 X高 倍阳性视野,计数200个细胞中阳性细胞,计算公式’:凋亡指数 (AI)一凋亡阳性细胞创细胞总数X 100%)反映凋亡程度。 4。统计学处理:①Fs/FasL表达与剂量的关系采用计数资 料的 X检验,两两比较采用 X’检验的分割方法,同时计算 Ken- dall’s值;②凋亡细胞数据采用秩和检验(Kru水al-wallis test*凋亡细胞与Fas/FasL表达的关系采用Speannan秩相关分 析方法(以上方法计算均采用SPSS10.0统计软件) ·二· 实验结果 1.肝细胞Fas/FasL检测:各种不同剂量的醋氨酚中毒标本 的肝细胞大部分有Fas/FasL表达,检测的49份标本中,均有43 份检出Fas/FasL表达,阳性率都为87.8%,二者都与药物剂量 呈显著正相关性。 2.肝细胞凋亡的检测:各种不同剂量的酪氨酚中毒的49个 标本,有43份检出凋亡细胞。经统计学处理,肝细胞凋亡程度 与醋氨酚药物剂量有统计学意义*=28.977,P<0.01人 并且呈显著正相关。 讨 论 目前,细胞内钙稳态失调[‘]、炎症介质、氧自由基、脂质 过氧化等学说都进一步从不同角度解释了酷氨酚中毒的可能发病 机制。现在认为CTL细胞介导的细胞免疫反应可能与醋氨酚中 毒的肝损伤有关。在许多肝病中(病毒性肝炎’‘’、肝癌”‘、酒 精性肝病[’]、免疫性肝病[‘]* 的肝细胞中均有Fas/FasL表达, Fas抗原和FasL结合后引起的细胞免疫反应可介导肝细胞的凋亡 和死亡。 本研究结果提示:醋氨酚中毒大鼠肝组织中高表达Fas/ FasL,醋氨酚剂量越大,Fas厅asL表达越强。因此,醋氨酚中毒 时,肝细胞表面表达Fas和FasL介导的细胞免疫反应,可能是 促进肝细胞凋亡、参与损伤肝细胞的重要机制之一。细胞毒性T 细胞*TL)损伤肝细胞的的机制主要是C’YL的抗原特异的T 细胞受体(TC)和CDS分子与靶细胞(肝细胞)表面的抗原 一MHCI结合,激活细胞内信号,产生穿孔素和颗粒酶,通过 ·3· 脱胞作用进人靶细胞,同时促进Fs和FsL的结合,两者共同 激活蛋白水解酶类如航门蛋白酶(*一P肪X破坏线粒体外膜, 同时启动凋亡信号,活化细胞死亡程序,造成肝细胞死亡或凋 亡[’]口 本研究还发现Fs/FasL可在同一肝细胞、同一区域中的不 同肝细胞表达,同时,FsL主要表达于假小叶中心,该区无淋 巴细胞浸润,而仅有肝细胞和间质细胞,说明FsL直接表达于 肝细胞表面,而不仅限于淋巴细胞,故Fs系统也可能不依赖于 CTL,而依赖于
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R595.4

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