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《中国医科大学》 2003年
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骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞

刘朝阳  
【摘要】: 背景与目的 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是具有多向分化潜能的成体干细胞,除了能向多种中胚层组织细胞分化,如骨软骨和脂肪细胞外,还可以诱导分化成非中胚层的细胞组织如:神经细胞,肺泡和小肠细胞。骨髓MSCs取材容易,来源充足,分离和培养技术比较成熟。自体MSCs诱导分化后进行移植治疗,解决了异体细胞免疫排斥的问题。MSCs的神经分化是非常有意义的:如果我们能找到合适的分化方法和诱导剂,我们就可以应用分化后的细胞来治疗多种神经疾病,如截瘫、中风,帕金森氏症等。在寻找诱导剂方面,Sanchez-Ramos,Woodbury,Kohyama,Reyes和Verfaillie工作主要集中在神经因子和抗氧化剂如beta-巯基乙醇等。在地球的另一边,中国的科学家在使用中药的提取物诱导MSCs分化成神经细胞方面也取得了很好的实验结果。 在本试验中,测试了几种抗氧化剂对MSCs的影响,以分析抗氧化剂对MSCs神经分化的影响。结果显示,只有beta-巯基乙醇具备此种诱导能力,排除了谷胱甘肽、抗坏血酸、维生素E等抗氧化剂的作用。本实验使用了beta-巯基乙醇、无血清的DMEM培养液和DMSO作为诱导方案,在诱导后,可见很多诱导产生的神经元样和胶质细胞样细胞。 诱导MSCs分化成神经细胞的目的主要是研究其分化的机制,以及将来应用于临床治疗神经系统损伤和退行性病变疾病(如截瘫、中风,帕金森氏症)。 实验材料与方法 取2-4月龄WISTAR大鼠,颈椎脱位法处死大鼠。无菌条件 下取股骨和胚骨的骨髓b人snd含10%胎牛血清的DMEM培养 液1000rpm离心10分钟,吹打b人两个培养瓶,置人37℃J% COh饱和湿度条件下培养,隔日更换培养液,当细胞达到70%融 合时,传代。当传到第五代时,取一瓶MSCS用胰酶消化,以8 X 10Vcm‘浓度接种在六孔板中的盖玻片上,应用免疫细胞化学方 法检测CD45人D90的表达。分别取第5代和第13代的MSCS,以 8 x 10~cm‘浓度接种于六孔板中的盖玻片上,制备细胞爬片,每孔 加 ZInL培养液。达到 80%融合时,更换新鲜培养液,并在培养液 中加人终浓度为 lrnM的 p一流基乙醇,诱导 24小时,PBS洗涤, 而后换成无血清的培养液。5小时后用含 2%DMSO的诱导液处 理5个小时。取诱导10小时后的细胞,参照博士德公司的SABC 试剂盒操作方法进行免疫细胞化学实验。一抗为NSE,H抗为与 一抗相对应的抗体。对照组为未经处理的细胞和用PBS代替一 抗的细胞。 实验结果 刚分离的MSCS贴壁后呈圆形,胞体透亮,折光性好,与造血 细胞混杂。在换液去除本贴壁细胞,不断培养中,MSCS以外的造 血细胞被去除,MSCS自然纯化。MSCS形态也是不均一的可以呈 现多种形态:长梭形,大而扁平,小而多颗粒的细胞等。免疫细胞 化学检测 CD45和 C规的结果,可见 CD45完全阴性,C删 70% 阳性。在MSCS g导后,细胞的形态变化不明显,大致上细胞的 边缘变得不是很规整,有很多的指状突起。在撤掉血清问更换 ·2· 为无血清的DMEM培养液)后20分钟内,即有细胞发生明显的形 态变化:细胞体开始收缩,胞体发亮(折光性强人有些细胞的细胞 质分裂呈现多突起的外观。细胞最终成为三角形、锥形,星形,和 长锥形等。一些细胞酷似神经细胞。但是有待功能学研究。所以 称为类似神经细胞。(Neuron-·ike cells人免疫细胞化学染色结 果:未诱导的细胞表达极其微量的NSE,无一抗对照组完全阴性, 而诱导的细胞 80%以上表达 N.SE,NSE表现为弥漫的胞浆着色。 讨 论 骨髓间充质细胞是目前研究比较热的一种成体干细胞,对于 它的分化的多向性科学家尤其感兴趣。在各种诱导剂中,选择相 应的无毒的诱导剂是至关重要的。 提高MSCS向神经元样细胞诱导的效率以及进一步得到功能 上与体内正常神经元一致的神经元是近年研究的热点。建立切实 可行的定向诱导分化为神经元.的条件,是MSCS最终运用于临床 治疗多种神经系统疾病首要和必需的基础工作。在诱导剂的选择 上,不同的实验室采取了不同的方法,中山医科大学采用了中药的 提取物作为诱导剂如:三七、后香、丹参,但是中药的有效成分还不 清楚;在国外,Woodb啡 et al采用的是 p一流基乙醇、DMSO和丁 化羟基苯甲醚(BHA)作为诱导剂,但是BHA有使细胞突变的可 能,故本实验并没有采取。Saxlchez-Romas使用的是RA8DNF 和NGF,Kohyama等使用的是.5-Aza-C,之后是BDNFJGF和 NTh处理细胞。 本研究显示MSCS的分化和抗氧化作用的关系并不明朗,因 为单纯使用某种抗氧化剂如:谷脱甘肽、维生素C和维生素E并 不能起神经分化作用,在处理后只能看到分裂相增加,增生活跃。 几大类的诱导剂,如beta一疏基乙醇可以透过细胞膜而起作用, ·3· ATRA具有核受体,其分化作用的实质还不清楚;通过受体起作用 的NGFSDNF对于促进细胞分化的机制也不清楚。所以把神经 细胞分化完
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q25

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【参考文献】
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【共引文献】
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【相似文献】
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