骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞

【摘要】： 背景与目的 骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有多向分化潜能的成体干细胞，除了能向多种中胚层组织细胞分化，如骨软骨和脂肪细胞外，还可以诱导分化成非中胚层的细胞组织如：神经细胞，肺泡和小肠细胞。骨髓MSCs取材容易，来源充足，分离和培养技术比较成熟。自体MSCs诱导分化后进行移植治疗，解决了异体细胞免疫排斥的问题。MSCs的神经分化是非常有意义的：如果我们能找到合适的分化方法和诱导剂，我们就可以应用分化后的细胞来治疗多种神经疾病，如截瘫、中风，帕金森氏症等。在寻找诱导剂方面，Sanchez-Ramos，Woodbury，Kohyama，Reyes和Verfaillie工作主要集中在神经因子和抗氧化剂如beta-巯基乙醇等。在地球的另一边，中国的科学家在使用中药的提取物诱导MSCs分化成神经细胞方面也取得了很好的实验结果。 在本试验中，测试了几种抗氧化剂对MSCs的影响，以分析抗氧化剂对MSCs神经分化的影响。结果显示，只有beta-巯基乙醇具备此种诱导能力，排除了谷胱甘肽、抗坏血酸、维生素E等抗氧化剂的作用。本实验使用了beta-巯基乙醇、无血清的DMEM培养液和DMSO作为诱导方案，在诱导后，可见很多诱导产生的神经元样和胶质细胞样细胞。 诱导MSCs分化成神经细胞的目的主要是研究其分化的机制，以及将来应用于临床治疗神经系统损伤和退行性病变疾病(如截瘫、中风，帕金森氏症)。 实验材料与方法 取2－4月龄WISTAR大鼠，颈椎脱位法处死大鼠。无菌条件 下取股骨和胚骨的骨髓b人snd含10％胎牛血清的DMEM培养 液1000rpm离心10分钟，吹打b人两个培养瓶，置人37℃J％ COh饱和湿度条件下培养，隔日更换培养液，当细胞达到70％融 合时，传代。当传到第五代时，取一瓶MSCS用胰酶消化，以8 X 10Vcm‘浓度接种在六孔板中的盖玻片上，应用免疫细胞化学方 法检测CD45人D90的表达。分别取第5代和第13代的MSCS，以 8 x 10～cm‘浓度接种于六孔板中的盖玻片上，制备细胞爬片，每孔 加 ZInL培养液。达到 80％融合时，更换新鲜培养液，并在培养液 中加人终浓度为 lrnM的 p一流基乙醇，诱导 24小时，PBS洗涤， 而后换成无血清的培养液。5小时后用含 2％DMSO的诱导液处 理5个小时。取诱导10小时后的细胞，参照博士德公司的SABC 试剂盒操作方法进行免疫细胞化学实验。一抗为NSE，H抗为与 一抗相对应的抗体。对照组为未经处理的细胞和用PBS代替一 抗的细胞。 实验结果 刚分离的MSCS贴壁后呈圆形，胞体透亮，折光性好，与造血 细胞混杂。在换液去除本贴壁细胞，不断培养中，MSCS以外的造 血细胞被去除，MSCS自然纯化。MSCS形态也是不均一的可以呈 现多种形态：长梭形，大而扁平，小而多颗粒的细胞等。免疫细胞 化学检测 CD45和 C规的结果，可见 CD45完全阴性，C删 70％ 阳性。在MSCS g导后，细胞的形态变化不明显，大致上细胞的 边缘变得不是很规整，有很多的指状突起。在撤掉血清问更换 ·2· 为无血清的DMEM培养液）后20分钟内，即有细胞发生明显的形 态变化：细胞体开始收缩，胞体发亮（折光性强人有些细胞的细胞 质分裂呈现多突起的外观。细胞最终成为三角形、锥形，星形，和 长锥形等。一些细胞酷似神经细胞。但是有待功能学研究。所以 称为类似神经细胞。（Neuron－·ike cells人免疫细胞化学染色结 果：未诱导的细胞表达极其微量的NSE，无一抗对照组完全阴性， 而诱导的细胞 80％以上表达 N．SE，NSE表现为弥漫的胞浆着色。 讨 论 骨髓间充质细胞是目前研究比较热的一种成体干细胞，对于 它的分化的多向性科学家尤其感兴趣。在各种诱导剂中，选择相 应的无毒的诱导剂是至关重要的。 提高MSCS向神经元样细胞诱导的效率以及进一步得到功能 上与体内正常神经元一致的神经元是近年研究的热点。建立切实 可行的定向诱导分化为神经元．的条件，是MSCS最终运用于临床 治疗多种神经系统疾病首要和必需的基础工作。在诱导剂的选择 上，不同的实验室采取了不同的方法，中山医科大学采用了中药的 提取物作为诱导剂如：三七、后香、丹参，但是中药的有效成分还不 清楚；在国外，Woodb啡 et al采用的是 p一流基乙醇、DMSO和丁 化羟基苯甲醚（BHA）作为诱导剂，但是BHA有使细胞突变的可 能，故本实验并没有采取。Saxlchez－Romas使用的是RA8DNF 和NGF，Kohyama等使用的是．5－Aza－C，之后是BDNFJGF和 NTh处理细胞。 本研究显示MSCS的分化和抗氧化作用的关系并不明朗，因 为单纯使用某种抗氧化剂如：谷脱甘肽、维生素C和维生素E并 不能起神经分化作用，在处理后只能看到分裂相增加，增生活跃。 几大类的诱导剂，如beta一疏基乙醇可以透过细胞膜而起作用， ·3· ATRA具有核受体，其分化作用的实质还不清楚；通过受体起作用 的NGFSDNF对于促进细胞分化的机制也不清楚。所以把神经 细胞分化完

【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2003
【分类号】：Q25