收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与初步表达

王勇  
【摘要】: 目的 近年来关于神经再生特别是中枢神经系统(CNS)损伤后再生的研究,一直是神经解剖学、神经生物学和神经免疫学等神经科学的研究热点。最新的研究结果揭示,哺乳动物成熟个体表现出的CNS再生能力缺乏并不是因为CNS自身不具有再生能力,而是这种能力被某种物质所强烈地抑制。目前认为这种再生抑制物质是由少突胶质细胞等分泌的一类髓鞘质蛋白,其中分子量为35,000dal的NI-35是目前所知的抑制再生能力V_H最强的一种蛋白因子。已有大量研究证实,在离体细胞实验和动物实验中应用抗NI-35的单克隆抗体对NI-35进行封闭,都使CNS再生获得了成功。本实验的目的是应用分子克隆技术,将已知的抗鼠NI-35单克隆抗体的重链可变区V_H和轻链可变区V_L基因进行重组,使二者通过一个由四个甘氨酸一个丝氨酸组成的重复序列短肽连接,构建出一种全新的抗NI-35重组单链抗体(anti-NI-35scFv),并使其在大肠杆菌中初步表达。 方法 从genebank中检索抗NI-35单克隆抗体(anti-NI-35mAb)重链可变区和轻链可变区的基因序列,设计一编码亲水性多肽接头(Gly_4Ser)_3的DNA片断,通过此连接肽将anti-NI-35单抗轻、重链可变区的基因连接起来,得到抗NI-35重组单链抗体基因序列。随后在此序列的两端引入BamHI和HindIII两个酶切位点,最后在轻链序列与HindIII酶切位点之间插入终止密码TAA。将设计好的抗体基因全长序列分为35个小片段分别进行人工合成,再通过改良的重叠延伸拼接法一次拼接所有的小片段,经两次PCR扩 增,在体外合成anti朴I-35scFv基因全长。回收PCR产物,经凝胶 电泳鉴定大小后,将目的基因插人至克隆质粒pUC4 中,构建含 有目的基因的克隆载体,经转化感受态细菌大肠杆菌DH5a、氨予 青霉素抗性筛选、BamHI和 Hindlll双酶切鉴定,LZ F primer (M13F:5’-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3’)和 R primer (M13R:5’-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3’)为通用引物进行菌 落PCR粗测及最终的DNA测序证实准确后,将目的基因酶切回 收,连接至表达质粒pET毛8a(+)中,构建含有目的基因的表达载 体,同样经过转化感受态细菌大肠杆菌BInl、卡那霉素抗性筛选。 BamHI和 Hindlll 双酶切鉴定,以 T7 promoter primer(5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’)、’I7 terminator primer(5’-TGC TAG ’IVfA ’ITG CTC AGC GG-3’)为引物进行菌落 PCR粗测正确后, 37 t摇菌扩增,测菌密度至 OD_为 0.6时,加人 InyG诱导表达。 继续培养至5小时,分别于诱导前、诱导后1小时、诱导后2小时 和诱导后3小时四个时间点对实验组和对照组取样,诱导后4j 小时只对实验组取样,随后对表达产物进行SDSIAGE初步检测。 结 果 含有目的基因的克隆载体经 DNA序列分析后表明,antiwI- 35SCFv基因全长729 hp,其中 VH 363 hp,位于整个序列的上游,编 码 121个氨基酸;V一 hp,位于整个序列的下游,编码 107个氨 基酸;中间以45 hP的连接肽相连。最终合成的基因序列与预先 设计的基因序列仅有一个碱基的差异,即429位点的C被替换成 了T,准确率为99.9%。SDSIAGE检测显示,表达产物为antiwI- 35SCFV与m叶ag的融合蛋白,其相对分子量是31 KD,与预期结 果一致,并在大肠杆菌中得到了较高水平的表达。 ·2· 结 论 成功构建了抗NI35重组单链抗体(anh刀I-35scFv)基因克隆 载体与表达载体,并在大肠杆菌中获得较高水平的表达。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 史依仁,郭先健,白雪峰,颜江华;抗人肺癌单克隆抗体3D_3 scFv基因构建及其在E.coli中的表达[J];中国肿瘤生物治疗杂志;1998年01期
2 李建东,王涛,李川,纪燕,梁米芳;抗汉坦病毒核蛋白单链抗体的构建与表达[J];病毒学报;2003年02期
3 张辛燕,冯捷,叶雪,姚煜,程洪艳,成夜霞,付天云;抗卵巢癌单链免疫细胞因子真核表达载体的构建及表达[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年04期
4 陈凌武,王晓波,陈炜,徐鸿绪,梅骅;重组免疫毒素scFv-psm-ETA对人前列腺癌细胞生长抑制作用的研究[J];中华泌尿外科杂志;2005年04期
5 周炜,张奉春,唐福林,董怡;抗SSA噬菌体抗体库的构建及鉴定[J];中华风湿病学杂志;2003年07期
6 李富祥,罗家琴;单链抗体的生物学特性及其在肿瘤和艾滋病诊断治疗中的应用[J];现代免疫学;2004年03期
7 钟小林,高会广,吉清,黄刚;一种可溶性单抗ScFv片段的表达及鉴定[J];第三军医大学学报;2003年08期
8 武国军,王禾,王栋,于磊,郝晓柯,白玉杰,王智,袁建林;多价抗人精浆蛋白/抗人CD_3双特异性单链抗体的构建及表达[J];中华泌尿外科杂志;2004年08期
9 邓宁,陈文吟,向军俭,饶桂荣,唐勇;亲和层析纯化重组人源性抗HBsAg Fab抗体[J];细胞与分子免疫学杂志;2004年05期
10 昌晓红,刘蓓,李艺,程洪艳,付天云,叶雪,冯捷,崔恒;卵巢癌抗独特型单链抗体3D_5ScFv的高效表达[J];中国生物化学与分子生物学报;2004年06期
11 赵小玲,荫俊,王慧,姜明,侯小军;人源抗狂犬病毒单链抗体库的构建及体外亲和筛选[J];细胞与分子免疫学杂志;2004年02期
12 高宁;单链重组抗体的表达及其临床应用[J];免疫学杂志;1998年01期
13 李莉;~(111)In标记人单克隆抗体H11 scFv片段用于人黑素瘤异种移植模型的快速显像[J];国外医学.放射医学核医学分册;2001年05期
14 隋建华,宋增璇,佘鸣,张丽艳,沈德诚,韩忠朝;KGla细胞免疫小鼠脾细胞scFv噬菌体展示文库的构建及其表达[J];中国免疫学杂志;2000年06期
15 杨章民,孔令洪,来宝长,王一理,司履生;Anti-CD3 scFv-B7.1真核表达载体的构建及在COS-7细胞中的初步表达[J];西安交通大学学报(医学版);2003年06期
16 王健,李锴男,孙妍琳,刘彦仿,付勇,刁建升,屈晓杰;人源抗肝癌单链抗体scFv-CD3ζ基因真核载体的构建[J];实用医药杂志;2004年05期
17 武国军,白玉杰,王栋,于磊,王智,王禾,药立波;抗人CD3单链抗体/p53四聚功能域融合基因的构建及表达[J];细胞与分子免疫学杂志;2004年05期
18 秦娜;;丙溴磷人源ScFv抗体的筛选与鉴定[J];太原师范学院学报(自然科学版);2008年02期
19 邢金良,杨向民,王永庆,姚西英,陈志南;抗人HAb18G分子单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的分泌表达[J];中国免疫学杂志;2003年07期
20 万海英,阮长耿;SZ-63单链抗体的基因构建、表达及免疫性研究[J];同济大学学报(医学版);2003年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 洪智慧;石怡珍;刘增礼;;抗ProGRP(31-98)单链抗体scFv的~(131)I标记及其体内生物学分布研究[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
2 高士争;张玉静;刘松财;郝军元;;抗猪脂肪细胞特异膜蛋白scFv噬菌体抗体库的构建及可溶性表达[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
3 高士争;张玉静;刘松财;郝军元;;抗猪脂肪细胞特异膜蛋白scFv与人IgG1Fc片段在毕赤酵母中的融合表达[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
4 高士争;李卫真;张曦;尹革芬;段刚;;抗脂肪细胞特异膜蛋白scFv噬菌体抗体库的构建及可溶性表达[A];中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第六次学术交流会论文集[C];2004年
5 黄吉城;武婕;郭波旋;张宏斌;相大鹏;师永霞;李小波;洪烨;郑夔;幸芦琴;;抗人禽流感病毒H5N1的人源化单链抗体(scFv)噬菌体文库的构建[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
6 武婕;陈秋霞;邹丽容;李晖;周杰;莫艳玲;柯昌文;;特异结合人禽流感病毒H5N1的scFv分子性能鉴定[A];2010广东省预防医学会学术年会资料汇编[C];2010年
7 张玉静;高士争;刘松财;郝军元;;抗猪脂肪细胞特异膜蛋白scFv基因地克隆及序列分析[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
8 武婕;柯昌文;李晖;陈秋霞;周杰;张欣;邹丽容;;特异结合人禽流感病毒H5N1的scFv分子生物学活性性能鉴定[A];新发和再发传染病防治热点研讨会论文集[C];2011年
9 解志刚;郭宁;施明;冯建男;于鸣;孙瑛勋;沈倍奋;;抗人P185~(erbB2)scFv-Fc融合蛋白的表达及活性分析[A];中国免疫学会第四届学术大会会议议程及论文摘要集[C];2002年
10 覃健萍;毕英佐;曹永长;马静云;;猪抗体可变区基因的克隆与序列分析[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王旋;双功能抗体融合蛋白IP10-scFv定向募集T淋巴细胞靶向治疗鼠脑恶性胶质瘤的研究[D];华中科技大学;2012年
2 刘俐伶;重组免疫毒素CD25scFv-α-luffin-KDEL的体外靶向生物学活性研究[D];第三军医大学;2010年
3 陈锐;核糖体展示人源性scFv文库的构建及筛选抗人LBP抗体的局限性分析[D];第三军医大学;2009年
4 郭军庆;免疫细胞因子IP10-scFv的构建及其抗肿瘤特性研究[D];武汉大学;2003年
5 施恒亮;抗成纤维细胞生长因子1单链抗体介导的乳腺癌治疗研究[D];东北师范大学;2011年
6 张平;抗人AFP单链抗体的制备和鉴定[D];四川大学;2003年
7 杨涛;利用噬菌体表面展示技术制备抗人肿瘤坏死因子α单链抗体及其人源化改造[D];山西医科大学;2004年
8 胡荷宇;抗转铁蛋白受体抗体新型分子的构建及其生物学特性研究[D];华中科技大学;2011年
9 金海龙;重组免疫毒素CTLA4-ScFv-Mel的构建、制备及活性研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2012年
10 杨炼;抗黄曲霉毒素B_1的单链抗体的筛选、表达和改造[D];江南大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王勇;抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与初步表达[D];中国医科大学;2003年
2 孙涛;抗NI-35重组单链抗体表达载体的构建与融合表达[D];中国医科大学;2004年
3 何志娟;Anti-CD28 scFv-C_H3-KCCYSL的分子克隆、表达及活性鉴定[D];南京师范大学;2012年
4 闫洁;HLA-A2/CD35scFv融合蛋白在昆虫杆状病毒载体系统中的表达与纯化[D];华中科技大学;2009年
5 洪智慧;~(131)Ⅰ标记抗胃泌素释放肽前体单链抗体scFv的实验研究[D];苏州大学;2011年
6 陈阿群;胃癌人源性ScFv噬菌体单链体库的构建和初步鉴定[D];郑州大学;2010年
7 田江红;核糖体展示人单链抗体库的构建及抗HCVNS5B蛋白的ScFv的筛选[D];第四军医大学;2010年
8 王雅楠;人源抗—抗GBM抗体单链抗体scFv3原核载体的构建、表达和纯化[D];郑州大学;2010年
9 邢小翠;DNA-PKcs单链抗体DPK3-scFv的原核表达纯化及生物学作用[D];安徽医科大学;2012年
10 熊林;新抗体Met4用于免疫组化评价乳腺癌Met表达水平的研究人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析[D];南京医科大学;2009年
中国重要报纸全文数据库 前9条
1 余海若;查清抗体的隐秘[N];大众科技报;2000年
2 ;单抗:造福人类指日可待[N];医药经济报;2002年
3 林宗辉 陈炳欣;H.264仍是移动电视主要编解码架构[N];电子资讯时报;2007年
4 孙丰雷 杨公涛 高 华;灵芝降糖作用的研究[N];中国中医药报;2006年
5 罗刚;肿瘤细胞产生Ig可促进肿瘤生长[N];健康报;2003年
6 张丁丁;芬发现哮喘新致病基因[N];中国医药报;2004年
7 许琦敏;酶“剪刀”裁出病原“监测仪”[N];文汇报;2008年
8 姚春霞;治愈普通感冒指日可待[N];医药经济报;2009年
9 ;抗体研发期待突破[N];中国医药报;2002年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978