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《中国医科大学》 2003年
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高糖对腹膜间皮细胞细胞外基质影响的研究

李晓兰  
【摘要】: 前言 腹膜透析(PD)是终末期肾脏病替代治疗的重要手段之一,其长期有效的进行有赖于腹膜透析效能的良好维持。随着腹透患者生存率的不断提高,腹膜超滤失败、腹膜纤维化等远期并发症逐渐得到重视。长期腹膜透析患者腹膜持续暴露于酸性、高渗、高糖的非生理性透析液,导致第一道生理屏障——腹膜间皮细胞(PMCs)发生显著的形态学改变:如细胞表面微绒毛消失、细胞增大甚至细胞剥脱、间皮细胞下基质增多,一些病人可出现基底膜增厚及间质中微血管壁增厚等糖尿病样病变,代之以大量纤维组织,形成无细胞区最终导致腹膜纤维化。上述结构改变会影响腹膜的透析效能:腹膜的通透性增加、葡萄糖(Glc)吸收加快,导致超滤下降。大量研究表明:高糖是造成PMCs损害进而导致透析效能下降、超滤能力丧失及腹膜纤维化的主要原因。腹膜间皮细胞可产生细胞外基质,它参与基底膜的构成对维持其结构的完整起重要作用。腹膜纤维化的组织学检查发现细胞外基质明显增多。因此有必要研究和探讨高糖对PMCs细胞外基质产生的影响,为减轻腹膜纤维化提供新的途径。而PMCs的体外培养则为该研究提供了细胞模型。 已有研究表明:肾小球系膜细胞在糖尿病相关因素:蛋白激酶C(PKC)激活剂——佛波酯(PMA)的作用下上调,并伴有细胞对Glc净利用的增加以及伴有细胞外基质的合成增加;参与了糖尿病肾病的发生发展。我们已完成的实验表明:PMCs暴露于高糖情况下,刺激了HKs在PMCs的表达,因此有必要进一步研究高糖在刺激HKs活性增加的同时是否也刺激了PMCs细胞外基质的合成及分泌。 本实验利用原代培养的PMCS,主要研究糖尿病相关因素:高 糖对PMCS细胞外基质合成及分泌的影响;并观察PKC $活剂 (PMAXPKC抑制剂(Glib976)对细胞外基质合成及分泌的影响, 为进一步探讨如何减少细胞外基质的合成及分泌从而为减轻腹膜 纤维化提供新的理论依据。 实验材料与方法 实验材料 1.实验动物:雄性SD大鼠 2.实验用细胞:原代培养的腹膜间皮细胞 3.细胞培养、传代及鉴定的相关试剂 4.检测细胞外基质层粘连蛋白(LNX IV型胶原(coilN)的放 免试剂盒 实验方法 1.胰蛋白酶消化法进行大鼠PMCS的原代培养 2.间接兔疫荧光法用于PMCS的鉴定 3.观察不同浓度的葡萄糖、PMA及PKC抑制剂对细胞外基质 层粘连蛋白(LN入 IV型胶原(colllV)影响 4.放免法测定细胞培养液中LN/Ollw的含量 实验结果 1.高糖对腹膜间皮细胞m、Cdw合成的影响呈浓度依赖 性。 O)葡萄糖浓度为2.5%人.25%的培养液剩激PMC824 b, LN分另增加2.7倍J.3倍(P<o.opes)。 *)葡萄糖浓度为1.5%在.5%/.25%的培养液刺激PMCs 双h,Cd*删增加ic.7倍、14.8倍(P<o.4his)、29倍(P<o. pl)。 ·2· 成亦增加,且有显著意义。 3.二 pmml/L PMA可使 PMCs LN、coilN合成增加 PAM组与 对照组相比 LN增加 7.9倍门<0.0005h Cdw增加 32倍汀<0. 0000)。 4.G{:)o976抑制了PMA对LN/ 的合成的影响。 PMCS暴露于20WilL e6976的培养液30分钟后再予 1卜nuno*L**A双h m、con w无明显增加(P>O.05)。 讨 论 一、腹膜间皮细胞的体外培养及鉴定 采用大鼠网膜作为细胞来源,采用改良胰酶消化法原代培养。 传代,经免疫荧光鉴定:细胞角蛋白抗体在胞浆内呈绿色荧光,证 实培养细胞为腹膜间皮细胞。 二、高糖对PMCS细胞外基质合成的影响 人体各种组织均有细胞外基质(ECM)构成支架,其可分为基 底膜和间质两大部分J型胶原hmwX层粘连蛋白(LN入纤维 粘连蛋白(F’N)都是ECM的重要组成部分,三者均参与基底膜的 构成并对维持其结构的稳定起重要作用。腹膜间皮细胞能够生成 细胞外基质。我们在细胞及分子水平报道了高浓度葡萄糖夕MA 等糖尿病相关因素对细胞外基质合成的影响,发现葡萄糖以浓度 依赖的方式增加 LN/ IV的合成;PMA可增加 LN/ 合成; ho976阻断T PMA对LNJ 合成的影响。 三*KC的中心环节作用 PKC是一组依赖Ca*和磷脂的蛋白激酶,在体内由胞内第 二信使二脂酷甘油(DAG)激活。已有实验证实高糖通过从头合 成途径产生DAG从而成为PKC激活剂,而高糖通过PKC途径对 HKs活性的激活,使间皮细胞对GIC的摄取增加,导致细胞内GIC 过利用,一方面使细胞外基质合成增加,将参与腹膜纤维化的形 ·3· 成,与透析效能下降有关;另一方面将促进糖基化终产物(AGE) 的沉积及基底膜增厚,使腹膜通透性增加,因而与超滤下降有关。 我们的实验也证实正常糖浓度下PMA可增加细胞外基质的合成, 而且该作用可被PKC抑制剂所抑制。 综上所述:高糖通过使 PMCS细胞外基质合成增加参与了 PMCS损害的发生发展过程,PKC在调节过程中起中心环节作用。 我们的
【学位授予单位】:中国医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R459.5

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